小檗碱联合吡喹酮对大鼠日本血吸虫病肝纤维化组织MMP-13与TIMP-1表达的影响
骆中华, 吕飞
华中科技大学同济医学院附属普爱医院消化科,武汉 430035

作者简介 骆中华(1969-),男,湖北武汉人,副主任医师,学士,研究方向:肝脏疾病防治。电话:(0)13071262798,E-mail:tomz120@163.com

摘要
目的

探讨小檗碱联合吡喹酮对血吸虫病大鼠肝纤维化的作用及其机制。

方法

感染日本血吸虫尾蚴后的大鼠80只,随机均分为4组(n=20)。模型对照组不作任何治疗;吡喹酮组在感染血吸虫尾蚴6周时给予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d;小檗碱组在感染血吸虫尾蚴6周时予小檗碱150 mg·kg-1·d-1灌胃6周;吡喹酮联合小檗碱组在感染血吸虫尾蚴6周时予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d后,继以小檗碱150 mg·kg-1·d-1灌胃6周。另取10只正常大鼠作为正常对照组。灌胃6周末检测各组大鼠肝组织丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及基质金属蛋白酶(MMP)-13、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达变化。

结果

与模型对照组比较,吡喹酮组、小檗碱组中肝组织MDA含量、TIMP-1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达水平明显下降(P<0.05),GSH-Px活性、MMP-13表达及MMP-13/TIMP-1比值明显升高(P<0.05)。吡喹酮组和小檗碱组差异无统计学意义(均P>0.05)。吡喹酮联合小檗碱组肝组织中MDA含量、TIMP-1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达水平分别为(2.215±1.316) nmol·mg-1,0.642±0.052,0.273 ±0.102,0.203±0.104,与吡喹酮组、小檗碱组比较,均明显下降(P<0.05);GSH-Px活性、MMP-13表达及MMP-13/TIMP-1比值分别为(21.89±1.54) nU·mg-1,0.588±0.027,0.726±0.138,与吡喹酮组、小檗碱组比较,均明显升高(P<0.05)。

结论

小檗碱可通过降低肝组织氧化应激水平,减轻MMP-13/TIMP-1表达比值失衡而抑制血吸虫肝纤维化,可与吡喹酮联用发挥协同、增效作用。

关键词: 小檗碱; 吡喹酮; 纤维化; ; 血吸虫病; 氧化应激; 基质金属蛋白酶
中图分类号:R975.5 文献标志码:A 文章编号:1004-0781(2016)01-0039-05 doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2016.01.010
Effects of Berberine Combined with Praziquantel on the Expression of MMP-13 and TIMP-1 in the Liver Fibrosis Tissue ofSchistosoma japonicum Infected Rats
Zhonghua LUO, Fei LYU
Department of Digestive,Puai Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Techology,Wuhan 430035,China
Abstract
Objective

To study the effect and mechanismof berberine combined with praziquantel on the liver fibrosis ofSchistosoma japonicum infected rats.

Methods

Eighty rats infected withSchistosoma japonicum were randomly divided into four groups(n=20).The model control group was untreated.The rats in praziquantel group were treated with praziquantel 500 mg·kg-1·d-1 by intragastric administration for 2 days,those in the berberine group were i.g.treated with berberine 150 mg·kg-1·d-1 for six weeks.The rats in berberine combined with praziquantel group were treated with berberine 150 mg·kg-1·d-1 for six weeks following praziquantel 500 mg·kg-1·d-1 i.g. for 2 days.By the 6th week after administration,the content of MDA,the activity of GSH-Px and the expressions of MMP-13,TIMP-1,typeⅠ and type Ⅲ collagen in liver tissue of mice were detected.

Results

Compared with the model control group,the content of MDA and the expressions of TIMP-1,typeⅠ and type Ⅲ collagen in liver tissue were decreased obviously (P<0.05) and the activity of GSH-Px,the expression of MMP-13 and the ratio of MMP-13/TIMP-1 were increased obviously (P<0.05) in both praziquantel and berberine groups,but there was no significant difference between these 2 groups (P>0.05).The content of MDA(2.215±1.316 nmol·mg-1),TIMP-1 expressions (0.642±0.052),and typeⅠ (0.273±0.102) type Ⅲ (0.203±0.104) collagenin liver tissue were decreased obviously (P<0.05).GSH-Px(21.89±1.54) nU·mg-1,MMP-13 (0.588±0.027)and the ratio of MMP-13/TIMP-1 (0.726±0.138) were increased markedly (P<0.05) in the combination group compared with the monotherapy.

Conclusion

Berberine may inhibit hepatic fibrosis bySchistosoma japonicum infection via reducing the level of oxidative stress and imbalance of expression ratio of MMP-13/TIMP-1,which may play a synergistic effect with praziquantel.

Keyword: Berberine; Praziquantel; Fibrosis; hepatic; schistosomal; Oxidative stress; Matrix metalloproteinases

日本血吸虫病肝硬化是导致门静脉高压、腹腔积液和上消化道出血的主要原因。目前认为即使经过杀虫治疗,晚期血吸虫病患者肝纤维化程度仍可继续进展,因此抗血吸虫肝纤维化治疗非常必要[1],而目前国内外尚无理想的抗纤维化药物。小檗碱是中药黄连提取物,具有抗炎、抗氧化作用[2,3]。研究表明小檗碱具有保护肝细胞、防治非酒精性脂肪性肝病的作用[4,5],但鲜见其作用于血吸虫肝病的深入研究报道。本实验以日本血吸虫尾蚴感染大鼠建立早期血吸虫肝纤维化模型后给予小檗碱及吡喹酮治疗,检测治疗前、后大鼠肝组织丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性以及基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(matrix metalloproteinase inhibitor-1,TIMP-1)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达变化,探讨小檗碱联合吡喹酮对血吸虫病肝纤维化的治疗作用及其机制。

1 材料与方法
1.1 实验动物

清洁级雄、雌性Wistar大鼠90只[实验动物生产许可证号:SCXK(鄂)2010-0009],体质量220~250 g,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心,置于亚屏障系统饲养室中饲养。造模时每只大鼠经腹部皮肤人工感染血吸虫尾蚴25条。

1.2 药物与试剂

盐酸小檗碱片(东北制药总厂,批准文号:国药准字H21022453,规格:每片0.1 g)。 吡喹酮片(武汉康隆世纪医药制造有限公司,批准文号:国药准字H11020269,规格:每片0.2 g)。上述药物使用时均以0.9%氯化钠溶液配制成混悬液。兔抗大鼠MMP-13单克隆抗体(批号:20130525)、兔抗大鼠TIMP-1单克隆抗体(批号:20130410)均购自上海宝曼生物科技有限公司。兔抗大鼠Ⅰ型胶原抗体(批号:201311)、Ⅲ型胶原抗体(批号:201311)及链霉亲和素-生物素复合物试剂盒(批号:SA1312)均购自武汉博士德生物工程有限公司。MDA(批号:201310)、GSH-Px(批号:201311)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 大鼠血吸虫病肝纤维化模型的建立及分组与给药方法

将80只大鼠(雄、雌性各40只)经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(每只25条)后,随机分为4组,每组20只。模型对照组:感染血吸虫尾蚴后不作任何治疗,正常方法饲养;吡喹酮组:感染血吸虫尾蚴6周后给予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d;小檗碱组:感染血吸虫尾蚴6周后给予小檗碱150 mg·kg-1·d-1灌胃6周(剂量参考文献[6]);吡喹酮联合小檗碱组:感染血吸虫尾蚴6周后继吡喹酮500 mg·kg-1·d-1治疗2 d后再给予小檗碱150 mg·kg-1·d-1灌胃6周。另取10只大鼠作为正常对照组(雄、雌性各5只)。灌胃6周末5组大鼠存活只数分别为10,12,13,15,10只,分别取各组大鼠肝组织保存待检。

1.4 MDA含量和GSH-Px活性测定

切取大鼠肝组织1.0 cm×0.5 cm,称质量,加入9倍量的0.9%氯化钠溶液,置于匀浆器,冰水中匀浆。再以3 000 r·min-1( r=5 cm)离心5 min,分别吸取上清液0.1 mL按照MDA、GSH-Px测定试剂盒提供的方法测定MDA含量和GSH-Px活性。

1.5 Western blot 检测各组大鼠肝组织MMP-13、TIMP-1表达

每份样本取肝组织50 mg,匀浆后裂解、离心取上清液,按照二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒说明定量测定蛋白。经电泳仪上分离后转移于硝酸纤维素膜上。以1:1 000的兔抗大鼠MMP-13、TIMP-1单克隆一抗4 ℃静置孵育过夜,再以1:10 000过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h,在暗室用电化学发光法(electrochemiluminescence,ECL)试剂盒发光显影,同时检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的表达作为内参对照。图片经吸光度图像扫描仪扫描,以Quantity One 软件对结果进行分析,检测各组大鼠肝组织MMP-13、TIMP-1与GAPDH 表达灰度的比值。

1.6 免疫组化检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达

采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法。采用MPZAS-500多媒体彩色病理图文分析系统,计算平均积分。

1.7 统计学方法

计量资料以均数 ±标准差( ±s)表示,采用SAS软件行方差分析,两组均数间的比较采用 q检验。以 P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 肝组织中MDA含量、GSH-Px活性变化

与模型对照组比较,吡喹酮组、小檗碱组、吡喹酮联合小檗碱组大鼠肝组织中 MDA含量均明显下降( q=4.25,5.12,5.20, P<0.05或 P<0.01)、GSH-Px活性均明显升高( q=3.32,4.78,4.92, P<0.05或 P<0.01)。与吡喹酮组比较,小檗碱组大鼠肝组织中MDA含量和GSH-Px活性无明显变化( P>0.05)。与吡喹酮组、小檗碱组比较,吡喹酮联合小檗碱组大鼠肝组织中 MDA含量明显下降,GSH-Px活性显著升高( q=3.76,2.51, P<0.05)。见表1

表1 5组大鼠肝组织中MDA、GSH-Px表达 Table 1 Expressions of MDA and GSH-Px in livers of five groups of rats ±s
2.2 大鼠肝组织MMP-13、TIMP-1表达变化

模型对照组较正常对照组肝组织MMP-13、TIMP-1表达明显增强( q=4.31,3.59, P<0.01),MMP-13/TIMP-1比值明显降低( q=2.10, P<0.01)。与模型对照组比较,吡喹酮组、小檗碱组、吡喹酮联合小檗碱组大鼠肝组织表达MMP-13明显增强( q=3.41,4.02,2.89, P<0.05或 P<0.01)、TIMP-1表达明显减弱( q=3.31,5.02,1.74, P<0.05或 P<0.01),MMP-13/TIMP-1比值明显升高( q=1.26,4.79,3.32, P<0.05或 P<0.01)。与吡喹酮组比较,小檗碱组大鼠肝组织中MMP-13、TIMP-1表达、MMP-13/TIMP-1比值无明显变化( P>0.05)。与吡喹酮组、小檗碱组比较,吡喹酮联合小檗碱组大鼠肝组织中MMP-13表达明显增强( q=4.41,5.10, P<0.05)、TIMP-1表达明显减弱( q=4.87,5.06, P<0.05),MMP-13/TIMP-1比值明显升高( q=3.92,4.24, P<0.05),见图1图2表2

表2 5组大鼠肝组织MMP-13、TIMP-1的表达 Table 1 Expression of MMP-13 and TIMP-1 in livers of five groups of rats ±s

图1 5组大鼠肝组织中MMP-13表达Fig.1 MMP-13 expression in livers of five groups of rats

图2 5组大鼠肝组织中TIMP-1表达Fig.2 TIMP-1 expression in livers of five groups of rats

2.3 肝组织中型胶原含量的变化

模型对照组、吡喹酮组、吡喹酮联合小檗碱组大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原呈棕黄色,密集片状,主要分布在虫卵肉芽肿内及汇管区。与模型对照组比较,吡喹酮组、小檗碱组、吡喹酮联合小檗碱组大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量显著下降( q=2.48,3.12,5.15, P<0.05或 P<0.01)。与吡喹酮组比较,小檗碱组大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量无明显变化( P>0.05)。与吡喹酮组、小檗碱组比较,吡喹酮联合小檗碱组大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原含量显著下降( q=4.46,5.11, P<0.05)。见图3图4表3

图3 5组大鼠肝组织中Ⅰ型胶原的表达(×200) A.正常对照组;B.模型对照组;C.吡喹酮组;D.小檗碱组;E.吡喹酮联合小檗碱组Fig.3 Expression of type Ⅰ collagen in livers of five groups of rats(×200) A.normal control group;B.model control group;C.praziquantel group;D.berberine group;E.praziquantel combined with berberine group

图4 5组大鼠肝组织中Ⅲ型胶原的表达(×200) A.正常对照组;B.模型对照组;C.吡喹酮组;D.小檗碱组;E.吡喹酮联合小檗碱组Fig.4 Expression of type Ⅲ collagen in livers of fives groups of rats(×200) A.normal control group;B.model control group;C.praziquantel group;D.berberine group;E.praziquantel combined with berberine group

表3 5组大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达 Tab.3 Expression of typeⅠ and type Ⅲ collagen in livers of five groups of rats ±s
3 讨论

肝纤维化以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成与降解失衡导致ECM过度沉积为主要特征[7]。肝脏ECM的代谢主要由MMPs及TIMPs调节[8]。在正常的肝组织中MMPs、TIMPs的活性表达很低。在肝纤维化早期时MMPs和TIMPs均受到激活而表达增高。随着肝纤维化的发展,MMPs的表达受到抑制而TIMPs表达继续升高,MMPs/TIMPs处于失平衡状态。MMP-13可裂解Ⅰ、Ⅲ型胶原,对于肝纤维化时降解ECM发挥至关重要作用[9]。MMP-13活性的抑制主要受特异性抑制物TIMP-1的调节。在肝纤维化发展过程中TIMP-1的表达增强,MMP-13/TIMP-1比值下降,导致ECM的合成与降解失衡是肝纤维化形成的重要因素,所以抑制TIMP-1过度表达将成为防治肝纤维化的新靶点[10]

MDA为脂质过氧化反应的主要产物,其含量可反映肝组织过氧化损伤的程度。研究表明脂质过氧化物MDA能促进肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化、增殖,增强其合成TIMP-1能力并大量合成以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质[11]。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶,它特异地催化还原型GSH对过氧化氢的还原反应,抑制脂质过氧化物对细胞膜结构和功能的损害。GSH-Px活性的恢复对于清除氧自由基、抗脂质过氧化、抑制HSC激活以及防治肝纤维化等方面具有重要意义[12]

本研究结果显示,模型对照组大鼠肝组织MMP-13、TIMP-1表达明显增强,MMP-13/TIMP-1表达降低,MDA含量增加,清除过氧化物的GSH-Px活性下降,提示血吸虫成虫、虫卵肉芽肿所产生的毒性代谢产物以及各种炎症细胞因子可导致过度氧化应激,降低肝脏清除过氧化物能力,致使MMP-13/TIMP-1比值失衡从而导致肝纤维化的发生、发展。经吡喹酮杀虫治疗后大鼠肝组织中MDA含量下降,GSH-Px活性恢复,MMP-13表达明显升高,TIMP-1表达明显下降,MMP-13/TIMP-1比值升高,Ⅰ、Ⅲ型胶原含量亦随之下降,但其含量仍明显高于正常,表明吡喹酮治疗可通过杀死血吸虫成虫,减少毒性代谢产物产生而减轻肝纤维化程度,但由于虫卵肉芽肿的持续作用而无法阻止肝纤维化的进一步发展,因此杀虫治疗后尽早加用抗肝纤维化药物十分必要。单纯小檗碱治疗能使MDA含量下降及GSH-Px活性恢复,MMP-13表达明显升高,TIMP-1表达明显下降,MMP-13/TIMP-1比值升高,Ⅰ、Ⅲ型胶原含量下降,表明小檗碱可减轻血吸虫肝纤维化程度,其作用可能与降低肝组织氧化应激水平,减轻MMP-13/TIMP-1比值失衡密切相关。较之吡喹酮组,小檗碱组肝组织中MDA含量、GSH-Px活性、MMP-13/TIMP-1比值和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平均无明显差异,表明杀虫治疗能减少乃至根除血吸虫虫卵及虫卵肉芽肿的来源,作为一种基础治疗方案在抗血吸虫纤维化治疗中仍处于重要地位。

本研究亦发现杀虫治疗后继之以小檗碱治疗时,大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平较之单纯的吡喹酮及小檗碱治疗明显下降,表明小檗碱在杀虫治疗后仍具抗纤维化作用,两种药物的联合治疗能较之单独应用的杀虫或抗肝纤维化治疗具有更好的效果。

目前国内外肝病学者普遍认为,肝纤维化可以逆转,而肝硬化不可逆转[13,14,15,16]。肝窦毛细血管化是肝纤维化的最基本、最初始特征。研究发现日本血吸虫尾蚴感染6周后,肝窦开始出现毛细血管化,此时尚处于血吸虫病肝纤维化病变的早期阶段[17]。本研究选择病变早期(尾蚴感染后6周)及时应用小檗碱行抗纤维化治疗,发现其具有显著地独立抑制血吸虫病肝纤维化的作用。在杀虫治疗后配合小檗碱治疗,发现肝纤维化程度进一步改善,表明小檗碱可配合杀虫治疗发挥协同、增效的抗肝纤维化作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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