人参皂苷Rg3为已分离得到的八十多种人参皂苷中抗肿瘤作用最显著的皂苷,能够诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长、侵袭和转移等,并有抗病毒、增强机体免疫力及抗脂质过氧化等广泛药理作用[1-2]。但人参皂苷Rg3在水中溶解度小,存在溶出速度慢、口服吸收差及生物利用度低等缺点,有报道称口服人参皂苷Rg3 0.8 mg·kg-1后最大血药浓度仅(4.4±0.8)μg·L-1,生物利用度2.63%[3],近年来有学者对人参皂苷Rg3剂型进行改造,包括固体分散体、微乳制剂、脂质体等,以期改善人参皂苷Rg3生物利用度,提高其抗肿瘤效果,但笔者尚未见有关人参皂苷Rg3纳米材料报道。纳米晶体药物是将纯药物形成亚微米颗粒的胶状分散体系,依靠电荷保护剂和立体保护剂维持稳定[4]。该剂型药物无需载体材料,具有分散性好、稳定性高等优点,不论是难溶于水的药物,还是既难溶于水又难溶于油的药物,都可以通过纳米晶体技术提高低溶解度药物的口服生物利用度,也可以悬浮于水中(纳米混悬剂)用于静脉注射[5-7]。或者冻存后制成纳米晶体冻干粉进行保存。如将羟基喜树碱制成纳米混悬液后提高了对人肝癌SMMC-7221细胞的抑制和杀伤作用[8]。故从目前的研究现状来看,把人参皂苷Rg3制成纳米晶体能够解决普通剂型生物利用度差的缺点,并且又优于脂质体等纳米载体药物,具有很深远的研究意义。笔者在本研究运用沉淀法与高压均质法联用技术制备人参皂苷Rg3纳米晶体,对其纳米晶体粒径及稳定性进行考察,评价其对肿瘤细胞的抑制作用,为新剂型的应用提供依据。
人参皂苷Rg3原料药(南京森贝伽生物科技有限公司,HPLC法测得含量≥98%,批号:SBJ141208),参一胶囊(以人参皂苷Rg3为单一成分的制剂,吉林亚泰制药股份有限公司,规格:每粒10 mg,批号:20140704);泊洛沙姆188(批号:SBJ141128)和甘露醇(批号:SBJ141120),南京森贝伽生物科技有限公司;甲醇(批号:WXBC1015V)和乙腈(批号:WXBC1011V)均为HPLC级,美国Sigma公司提供;噻唑盐(MTT,美国Sigma公司);DMEM细胞培养基(批号:AAF202144)和胎牛血清(批号:NZJ1221),美国HyClone公司提供;HepG2肝癌和A549肺癌肿瘤细胞株,浙江工业大学生物环境学院提供。
AH-PILOT高压均质机(ATS Engineering Inc);85-1磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司);DW-HL388-86 ℃超低温冰箱(中科美菱低温科技股份有限公司);FD-1-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);Zetaszier Nono-S90激光粒度仪(英国马尔文公司);Shimadzu UFLC液相色谱仪(日本Shimadzu公司);Multiskan MK3型酶标仪和Revco Elite Ⅱ型二氧化碳(CO2)培养箱(奥赛飞世尔科技公司);CK40型倒置显微镜(Olympus公司);HITACHI CR21G3型冷冻离心机(天美科学仪器有限公司)。
取对数生长期的HepG2和A549细胞株,用新鲜10%全培养基配成5×104个·mL-1细胞悬液,每孔100 μL,即每孔5 000个,接种于96孔细胞培养板,板四周一圈用磷酸盐缓冲液(PBS)填充,置37 ℃、5%CO2培养箱中过夜,待细胞贴壁后进行实验。
称取人参皂苷Rg3原料药60 mg,溶于甲醇2.4 mL作为有机相;300 mg泊洛沙姆188溶于纯化水30 mL制备水相;在室温下将药物溶液有机相滴加到搅拌下的水相中制成粗混悬液,再置于高压均质机,在28 MPa压强下循环4次,48 MPa压强下循环10次制得纳米混悬液。将制得的纳米晶体混悬液20 mL与甘露醇0.5 g(2.5%,
激光粒度仪对人参皂苷Rg3纳米晶体混悬液及冻干粉的粒径及多分散系数进行表征,并将混悬液在2~8 ℃条件下放置1周、1个月后考察其稳定性。纳米晶混悬液不经稀释直接测定,冻干粉用适量纯化水复溶后测定,每个样品均测定3次,求均数±标准差(
采用HPLC法测定并绘制人参皂苷Rg3标准曲线,称取一定量人参皂苷Rg3纳米冻干粉,甲醇溶解,测得峰面积,计算主药含量[10]。
采用MTT法,选用HepG2肝癌和A549肺癌肿瘤细胞株评价抗肿瘤作用。取参一胶囊一粒(相当于10 mg人参皂苷Rg3),先用甲醇溶解,再用培养基稀释至一定浓度,称取0.054 5 g人参皂苷Rg3纳米冻干粉(相当于2 mg人参皂苷Rg3),用培养基稀释至相同浓度。 用移液枪小心吸弃96孔板孔内的培养上清液,分别设置人参皂苷Rg3纳米晶混悬液组、参一胶囊组、药物辅料组、正常对照组(不加药物,但加入等容积细胞悬液)和空白对照组(不含细胞)。每组设4个复孔,加入试液100 μL,加药后继续置于培养箱中培养48 h后取出,倒置显微镜观察肿瘤细胞形态学变化,并进行MTT检测。向每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,继续培养4 h后终止培养,用移液枪小心吸弃孔内培养上清液,每孔加入二甲亚砜DMSO 150 μL,置微孔振荡器上振荡5 min,待紫色甲瓒完全溶解后,于酶标仪490 nm波长处测定吸光度(
采用SPSS 17.0版统计软件进行分析,计量资料用均数±标准差(
人参皂苷Rg3纳米晶体的粒径(284±14) nm,多分散系数(polydispersity,PI)为0.156±0.007(
冻干粉质地疏松,形态美观,加水振摇片刻即分散均匀,并有轻微乳光,根据标准曲线,浓度73.4 μg·mL-1,即每克纳米冻干粉含人参皂苷Rg3为36.70 mg。
本实验采用MTT法考察人参皂苷Rg3纳米晶体混悬液的体外抗肿瘤作用,同时将参一胶囊作为对照,按抑制率来计算IC50值。结果可见
经IC50公式计算可得,纳米晶体混悬液与参一胶囊对HepG2细胞的IC50分别为(65.59±3.62)与(97.64±10.48) μg·mL-1;对A549细胞的IC50值分别为(56.36±2.14 )与(83.26±7.44) μg·mL-1,均差异有统计学意义(
本研究运用沉淀法与高压均质法联用技术制备人参皂苷Rg3纳米晶体,并对其体外抗肿瘤作用进行比较。结果成功制备多分散系数理想且粒径较小的纳米剂型,稳定性良好。在体外抗肿瘤活性测定中,人参皂苷Rg3纳米晶混悬液与参一胶囊对HepG2细胞与A549细胞均有较强的增殖抑制作用,并且呈现明显的浓度依赖关系。说明本研究制得的人参皂苷Rg3纳米晶混悬液较市售参一胶囊有更好的抑制肿瘤细胞作用。本研究初步证明人参皂苷Rg3纳米晶体有一定药效,但该纳米体内抗肿瘤效果尚需进一步研究。
The authors have declared that no competing interests exist.