Balb/c小鼠,雄性,SPF级,4周龄,购自广东省医学实验动物中心,实验动物生产许可证号:SCXK(粤)2013-0005,实验动物合格证号:0060844。
7300 Real Time PCR system(美国ABI公司),Mini PROTEAN电泳系统(美国Bio-Rad公司),ChemiDoc XRS+成像系统(美国Bio-Rad公司),DTX880多功能酶标仪(美国Beckman公司 )。TP1020自动脱水机(北京悦泰行科技发展有限公司),透射电镜(日立H-600),RM2135 Leica切片机,HI1210 Leica摊片机,HI1220 Leica烘片机,EG1160Leica自动包埋机(Leica)等。
葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS,美国Sigma公司,货号:D9806);甲醛、无水乙醇购自广州国药集团;磷酸盐缓冲液(PBS)、0.9%氯化钠溶液、10%水合氯醛购自广州科宏生物技术公司;兔抗小鼠claudin-1、claudin-3一抗分别购自武汉博士德生物有限公司(货号:BA3088-1)和北京中杉金桥生物技术有限公司(货号:ZA-0363);兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体(美国Sigma公司,货号:SAB2701826);山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:zb2307);一抗稀释液、二抗稀释液购自江苏碧云天公司;二甲苯、Harris苏木精液、伊红染色液、1%盐酸乙醇、手术器械等;0.5及1.5 mL Eppendorf管购自美国AEGEN公司。
四君子汤组方:党参15 g、白术12 g、茯苓15 g、炙甘草6 g(药材购于采芝林药业连锁店,经广州中医药大学中药标本中心张秋镇老师鉴定,所购药材均符合《中华人民共和国药典》2015年版标准),用纯化水煎提取四君子汤有效成分,浓缩配制,1 mL药液相当于原生药1 g,过滤分装,4 ℃保存备用;美沙拉嗪(商品名:艾迪莎,批准文号:进口药品注册证号H2010062,法国博福-益普生公司生产)。
参照文献[5]报道,取4周龄Balb/c小鼠90只,适应性喂养1周后,分为模型对照组,四君子汤小、中、大剂量组,美沙拉嗪组,正常对照组,每组15只。除正常对照组外,其余各组饮用水中加入3%DSS,自由饮用2周。自第3周起,模型对照组予等量0.9%氯化钠溶液灌胃;四君子汤小、中、大剂量组按成人用药量的3,6,12倍给药,即3.12,6.24,12.48 g·kg-1(参照体表面积折算),将药物用纯化水配成429,858,1 716 g·L-1,小鼠灌胃给药体积0.4 mL·(10 g)-1;美沙拉嗪组予美沙拉嗪,0.4 g·kg-1(成人用药量6倍),均每天1次,连续1周。观察小鼠毛发、体质量、耗食、大便、耗水。
第3周末将小鼠处死,迅速剖取全部结肠(从回盲瓣至肛门),选择性取材(挑取溃疡最明显处病变肠段)沿纵轴切开,分为3部分,将第1部分以0.9%氯化钠溶液洗净,置10%中性甲醛溶液固定,第2部分置电镜固定液中固定,剩余部分液氮保存,备测。
1.7.1 结肠病理形态观察 切取病变处,流水冲洗,放入生物脱水机逐级脱水,透明、浸蜡、石蜡包埋切片4 μm,常规苏木精-伊红(HE)染色,封片,光镜下观察结肠黏膜组织形态学变化情况。
1.7.2 结肠黏膜超微结构变化 结肠标本按前固定→洗涤后固定→脱水→浸透、包埋→修整→切片,捞片→醋酸铀、柠檬酸铅染色程序处理,透射电镜观察。
1.7.3 结肠黏膜claudin-1、claudin-3蛋白及其mRNA表达 实时荧光定量PCR法(RT-PCR),以GAPDH为内参,检测claudin-1、claudin-3 mRNA表达。细胞总RNA提取后进行逆转录,之后用RT-PCR反应体系扩增,反应结束后,运行熔解曲线程序,分析引物特异性。用7300 System SDS软件分析数据,统计各组ΔΔCt值,计算相应RQ值,比较各组 mRNA的表达水平。claudin-1、claudin-3、GAPDH引物序列见
用SPSS11.5 for Windows版软件进行数据处理与分析,计量资料以均数±标准差(
正常对照组结肠黏膜完整,腺体排列整齐,偶见炎症细胞浸润;模型对照组结肠黏膜表面出现不同程度的缺损或脱落坏死,部分溃疡形成,隐窝消失,固有层大量炎症细胞浸润,黏膜肌层增厚水肿,黏膜下层血管扩张,甚至出血,较多红细胞、嗜酸粒细胞浸润;美沙拉嗪组结肠黏膜基本修复完整,极少数仍见残缺断裂,腺体增生,排列尚整齐,杯状细胞增多,出血点消失,仍可见较多炎症细胞浸润。
四君子汤小剂量组大部分结肠黏膜基本修复,腺体增生,仍有肠黏膜剥脱缺损现象,杯状细胞增多,炎症细胞浸润较明显;四君子汤中剂量组结肠黏膜大部分有修复迹象,腺体排列基本整齐,少数黏膜腺体残缺,黏膜肌层不增厚,少量出血,较多炎症细胞浸润;四君子汤大剂量组结肠黏膜基本修复完整,腺体排列基本整齐,出现杯状细胞,固有层炎症细胞浸润(
正常对照组微绒毛规则,排列整齐,较多杯状细胞,线粒体丰富,嵴结构清楚,粗面内质网未见改变。模型对照组上皮细胞表面微绒毛稀疏,长短不一,形态不规则,上皮细胞连接间隙增宽,杯状细胞减少,胞质内有空泡,线粒体肿胀,结构不清,部分嵴消失,个别内质网扩张,或呈空泡变。美沙拉嗪组微绒毛不稀疏,形态正常,排列紊乱,杯状细胞数目较多,线粒体轻微肿胀,线粒体嵴结构存在,粗面内质网病变不明显。四君子汤小剂量组微绒毛形态较规则,排列整齐,杯状细胞较多,线粒体肿胀,嵴结构不清,个别内质网扩张。四君子汤中剂量组微绒毛较密,形态较一致,排列较整齐,杯状细胞较多,线轻度肿胀,嵴结构不清,内质网病变不明显。四君子汤大高剂量组微绒毛偏稀疏,形态较一致,多数排列整齐,杯状细胞增多,线粒体嵴结构清楚,粗面内质网病变不明显(
祖国医学虽无UC病名,但是对于类似本病的记载较早。《黄帝内经》中将本病称为“肠澼”。《素问·太阴阳明篇》 云:“饮食不节,起居不时者,阴受之。阴受之则入五脏。…入五脏则满闭塞,下为飧泄,久为肠澼。”此可谓类似本病的最早记载。笔者多年临床实践亦证实,UC发病临床以“脾虚”为本,湿热瘀毒为标贯穿疾病始终,发作期以邪气实为特点,缓解期以正气虚为特点,采用益气健脾法治疗UC具有明确缓解UC疗效,但其具体效应靶点不明。前期笔者研究发现,UC存在结肠黏膜上皮细胞凋亡加速伴结肠黏膜固有层内淋巴细胞凋亡减慢特点;结肠黏膜上皮细胞屏障破坏、黏膜通透性增加,大量抗原漏过,导致炎性细胞持续活化,造成靶器官黏膜组织受损,炎症、坏死、溃疡等变化,在UC的发病中占据重要地位[6-7]。研究发现,紧密连接(tight junction,TJ)是正常上皮细胞稳态的关键结构,TJ完整性的丢失直接影响细胞的营养摄取、细胞增殖和迁移,claudins 是TJ的主要封闭蛋白[8]。claudins调控上皮或内皮细胞间黏附、极性、上皮增生的微环境及屏障功能,其变化涉及炎症、感染等多因素,与炎症性肠病发生、发展有着非常重要的联系。笔者基于上述研究基础,从结肠黏膜超微结构以及紧密连接蛋白claudin-1、claudin-3变化角度,探讨四君子汤防治UC研究。
本研究发现,UC小鼠结肠黏膜上皮细胞屏障被破坏,伴claudin-1、claudin-3表达减少。予四君子汤治疗后,结肠黏膜上皮细胞屏障修复,claudin-1、claudin-3表达上升。claudins 是一类跨膜蛋白,自1999 年SWISSHELM等首先克隆出人类claudin-1基因,迄今claudins 在人体内至少有24 种不同蛋白已经得到确认,每一种Claudin分子均有4 个疏水跨膜区域,N 末端和C末端位于细胞膜内,细胞膜外形成2个长度不等的环,膜内的C末端与胞质内的闭合蛋白ZO-1、ZO-2、ZO-3 相连,膜外的2个环与邻近细胞的同型环相接,如此构成细胞间TJ[9-10]。
结合本实验结果,笔者认为四君子汤对肠上皮细胞病理损伤有明显治疗作用,能够促进黏膜修复,提高溃疡愈合的效用。上皮屏障的完整性以及上皮细胞内的TJ阻止了肠内细菌和大分子物质通过固有层。黏膜上皮细胞不断更新对肠黏膜损伤的修复,以及防止肠腔内细菌入侵感染有重要意义。由此,笔者推测四君子汤可能通过调控claudin-1、claudin-3蛋白及其mRNA表达,恢复细胞连接的亚细胞结构,提高肠上皮细胞有丝分裂指数,促进肠上皮微绒毛生长,加速上皮细胞更新,利于上皮细胞黏膜屏障修复,发挥缓解UC的作用。
The authors have declared that no competing interests exist.