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医药导报
医药导报, 2016, 35(11): 1259-1261
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2016.0.24
超高效液相色谱法快速测定参麦注射液中6种皂苷类成分含量
刘婷, 徐虹
浙江省舟山市食品药品检验检测研究院,舟山 316021
中图分类号: R286     文献标识码: B     文章编号: 1004-0781(2016)11-1259-03
摘要: 目的建立超高效液相色谱法同时快速测定参麦注射液中6种人参皂苷成分含量的方法。方法采用Aglient Eclipse plus C18(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)为色谱柱,以乙腈(A)-水(B)为流动相梯度洗脱,流速0.3 mL·min-1,检测波长203 nm,柱温25 ℃,进样量0.5 μL。结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd在15 min内出峰,色谱峰之间具有良好的分离度;并且分别在0.035 9~0.448 8,0.028 3~0.353 5,0.036 8~0.460 5,0.026 5~0.331 5,0.019 1~0.238 9,0.028 5~0.355 8 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系(r>0.999);平均加样回收率分别为99.26%,99.06%,101.81%,99.50%,98.60%,100.47%(n=6)。结论该方法分析时间短,分离效能好,可用于快速高效测定参麦注射液中6种皂苷类成分的含量。
关键词: 参麦注射液 ; 人参皂苷Rg1 ; 人参皂苷Re ; 人参皂苷 ; 含量测定

Abstract:

参麦注射液由红参和麦冬提取制成,具有益气固脱、养阴生津、生脉的作用。用于治疗气阴两虚型之休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺源性心脏病、粒细胞减少症,能提高肿瘤患者免疫机能,与化疗药物合用有一定增效作用,为临床常用中药注射品种之一[1]。人参皂苷是参麦注射液主要活性成分之一,现行质量标准是国家药品标准WS3-B-3428-98-2010[2],对3种人参皂苷(Rg1、Re、Rb1)的含量测定采用高效液相色谱(HPLC)法,乙腈(A)-水(B)为流动相,梯度洗脱,分析时间为95 min,且人参皂苷Rg1和Re,人参皂苷Rb1和相邻峰的分离度较小,对色谱柱性能要求很高。笔者在本实验中采用超高效液相色谱(UPLC)法具有高分辨率、高灵敏度、分析时间短、节约试剂等优点[3-4],分析时间缩短了75 min,并可同时测定6种人参皂苷成分(Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd),且相邻色谱峰之间的分离度良好,可为参麦注射液质量标准的提高提供参考。

1 仪器与试药
1.1 仪器

Aglient 1290 infinity超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司,包括G1314E可见紫外检测器,G1316C柱温箱,G4226A自动进样器,G4220B二元泵,ChemStation化学工作站);Sartorius CPA225D电子天平(赛多利斯科学仪器股份公司,感量:0.01 mg)。

1.2 试药

人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd对照品(批号分别为110703-201027,110754-201324,110704-201424,111715-200802,111818-201001,含量分别为96.3%, 92.7%, 93.7%,94.8%,94.4%)均购于中国食品药品检定研究院,人参皂苷Rc对照品(批号:PS0903FA1S,含量:98%)购于上海源叶生物科技有限公司;乙腈为色谱纯(美国TEDIA试剂公司),实验用水为超纯水。参麦注射液(雅安三九药业有限公司,批号:150301010,150504010,150505010)。

2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备

2.1.1 混合对照品储备溶液 取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd对照品适量精密称定,置10 mL量瓶中,加20%乙腈溶解并稀释至刻度,制成浓度分别为1.795,1.414,1.842,1.326,0.955 6,1.423 mg·mL-1混合对照品储备溶液。

2.1.2 混合对照品溶液 精密吸取“2.1.1”项混合对照品储备溶液0.2,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL,置10 mL量瓶,加20%乙腈至刻度,制成混合对照品溶液1~6#。

2.2 供试品溶液的制备

取参麦注射液适量,用孔径0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.3 色谱条件 色谱柱:Aglient Eclipse plus C18(2.1 mm×50 mm,1.8 μm);流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~8 min,19%A;~15 min,19%A→40%A);流速:0.3 mL·min-1;检测波长:203 nm;柱温:25 ℃;进样量:0.5 μL[5-6]。

在上述色谱条件下,6种皂苷成分与相邻峰的分离度均>1.5,理论板数按人参皂苷Rg1峰计算大于5 000,对照品和供试品色谱图见图1。


图1 对照品(A)与样品(B)UPLC图

2.4 线性关系考察

取“2.1.2”项1~6#混合对照品溶液,按“2.3”项下谱条件测定。以浓度为横坐标(X),相应的峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线。见表1。

表1 线性关系结果
化合物名称 线性回归方程 线性范围/
(mg·mL-1)		 r
人参皂苷Rg1 Y=274.0X+0.260 6 0.035 9~0.448 8 0.999 8
人参皂苷Re Y=270.9X+0.259 3 0.028 3~0.353 5 0.999 8
人参皂苷Rb1 Y=401.6X-0.426 3 0.036 8~0.460 5 0.999 9
人参皂苷Rc Y=361.6X+2.865 0.026 5~0.331 5 0.999 7
人参皂苷Rb2 Y=344.5X+0.985 0 0.019 1~0.238 9 0.999 7
人参皂苷Rd Y=175.7X+1.261 0.028 5~0.355 8 0.999 6

表1 线性关系结果

2.5 精密度实验

取“2.1.2”项下4#混合对照品溶液,按“2.3”项色谱条件连续进样6次,记录峰面积。结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd峰面积的RSD(n=6)分别为0.89%,0.87%,0.81%,1.2%,1.5%,1.6%,表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一批号参麦注射液样品(批号:150301010),按“2.2”项方法平行制备6份供试品溶液,按“2.3”项色谱条件进样,记录峰面积。按外标法以峰面积计算含量,结果样品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的平均含量分别为0.321,0.176,0.314,0.150,0.124,0.164 mg·mL-1,RSD(n=6)分别为1.1%,1.4%,1.1%,1.2%,1.6%,1.8%,表明方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

取同一批号参麦注射液样品(批号:150301010),用微孔滤膜过滤后,按“2.3”项下色谱条件,分别在0,2,4,6,8,12,24 h进行测定,记录峰面积。结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd峰面积的RSD(n=7)分别为1.2%,1.3%,1.1%,1.1%,1.2%,1.6%,表明供试品溶液中6种皂苷成分在室温条件下24 h内基本稳定。

2.8 加样回收率实验

精密吸取已知含量的样品(批号:150301010)1 mL,共6份,精密加入4#混合对照品1 mL,混合均匀,用微孔滤膜过滤后,按“2.3”项下色谱条件进样,结果见表2 。

表2 6种人参皂苷加样回收率实验结果 n=6
成分 原有量 加入量 测得量 平均回收
率/%		 RSD/
%
mg
Rg1 0.321 0.269 0.588 99.26 1.0
Re 0.176 0.212 0.386 99.06 1.4
Rb1 0.314 0.276 0.595 101.81 0.8
Rc 0.150 0.199 0.348 99.50 1.5
Rb2 0.124 0.143 0.265 98.60 1.8
Rd 0.164 0.213 0.378 100.47 2.0

表2 6种人参皂苷加样回收率实验结果 n=6

2.9 样品含量测定

取3批参麦注射液,用微孔滤膜过滤后,按“2.3”项下色谱条件进样,以外标法计算样品中6种皂苷类成分的含量,结果见表3。

表3 参麦注射液中3种皂苷成分含量测定结果 mg·mL-1
批号 Rg1 Re Rb1 Rc Rb2 Rd
150301010 0.321 0.176 0.314 0.150 0.124 0.164
150504010 0.330 0.182 0.322 0.160 0.142 0.170
150505010 0.328 0.180 0.330 0.156 0.130 0.154

表3 参麦注射液中3种皂苷成分含量测定结果 mg·mL-1

3 讨论
3.1 色谱条件的选择研究

3.1.1 流动相比例的选择 笔者在本实验选取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd为指标性成分,对参麦注射液进行含量测定。由于6种皂苷类成分结构相似,分离困难,为达到较好的分离效果,实验采用梯度洗脱[7-9]的方法,对洗脱梯度进行优化,优化比较后确定“2.3”项下色谱条件进行测定。

3.1.2 柱温的影响 考察了柱温10,15,20,25,30,35 ℃对分离度的影响,结果表明柱温低于30 ℃时,6种人参皂苷的分离度较好。考虑到温度低柱压会升高,为保护色谱柱在合理的压力范围内,选择柱温为25 ℃。

3.1.3 流速的影响 考察流速0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mL·min-1对分离度的影响,结果表明流速过高或者过低,6种人参皂苷与相邻峰的分离度均达不到要求。在0.3 mL·min-1时分离度最佳。故选择流速为0.3 mL·min-1。

3.2 与HPLC法比较

考察该法与HPLC法6种皂苷类成分的含量的测定结果,两者数据基本相同。但样品的分析时间缩短了75 min,该法既提高检测速度和灵敏度,又降低了有机溶剂的消耗量,适用于含人参制剂中6种皂苷类成分含量的快速测定。

The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
[1] 曹树萍,聂黎行,王钢力,等.UPLC法用于参麦注射液及其中间体的皂苷含量研究[J].药物分析杂志,2014,34(7):1264-1268.
目的：建立超高效液相色谱法（UPLC）同时测定参麦注射液及其中间体中9个人参皂苷含量。方法：采用WATERS ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.8μm）,流动相为乙腈（A）-水（B）,梯度洗脱（0～8 min,2%A→10%A;8～16 min,10%A→22%A;16～18 min,22%A→22%A;18～30 min,22%A→46%A;30～36 min,46%A→60%A）,流速为0.4 mL·min^-1,检测波长203 nm。结果：本法可在36 min内完成一次色谱分析,9个主要成分（Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd和Rg3）色谱峰之间具有较好的分离度,回收率在95%～105%之间。结论：本法能同时测定参麦注射液及5个中间体中9个人参皂苷成分,可检测参麦注射液及中间体的质量,并可为生产企业改善工艺提供参考。
URL    
[本文引用:1]
[2] 国家食品药品监督管理局国家标准WS3-B-3428-98-2010[S].2010.
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采用超高效液相色谱法测定参麦注射液中间产品中的人参皂苷Rg1、Re和Rb1。参麦注射液中间产品经0.2μm滤膜过滤,以ACQUITY UPLC shield BEH RP18色谱柱为分离柱,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,紫外检测波长为203nm。人参皂苷Rg1、Re和Rb1的质量浓度在0.081 8~0.409 2g·L-1范围内与峰面积呈线性关系,检出限(3S/N)分别为0.652,0.479,0.916mg·L-1。加标回收率在99.9%~100%之间,测定值的相对标准偏差(n=9)在0.47%~0.64%之间。
DOI:10.11973/lhjy-hx201509011      URL    
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目的 建立同时测定脉络宁注射液(牛膝、玄参、石斛、金银花)中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁 酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸和肉桂酸的UPLC方法 .方法 采用WatersAcquityUPLC系统；色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(3.0 mm×100 mm,2.7 μm)；流动相为甲醇-0.1％乙酸溶液,梯度洗脱；体积流量0.4 mL/min；柱温25℃；检测波长为327 nm和278 nm.结果 线性范围内8种有机酸的峰面积与其相应质量浓度呈良好的线性关系,平均加样回收率为98.2％ ～ 101.7％.结论 该法简单、快速、准确和重复性好,可用于脉络宁注射液的质量控制.
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目的:测定不同生产厂家参麦注射液中人参皂苷Rg1与人参皂苷 Re的含量.方法:采用高效液相色谱法,Global C18柱(4.6 mm×250.0mm,5 μm),流动相为乙腈(A)-水(B),进行梯度洗脱,流速1.0 mL·min-,检测波长203 nm,柱温30℃.结果:人参皂苷Rg1和人参皂苷Re分别在0.0404 ～1.6160 μg(r =0.999 8),0.030 7～1.226 4μg(r =0.999 9)与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率(n=6)人参皂苷Rg1为100.57％,人参皂苷Re为100.12％.结论:本实验所建方法简单、高效, 分离度好,精密度高,可用于测定不同厂家参麦注射液中人参皂苷Rg1和Re的含量.
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目的：建立复方丹参片中三七皂苷R1、人参皂苷Rgl、人参皂苷Rbl的含量测定方法。方法：采用超高效液相色谱法，色谱条件：ThermoScientificHypersilODSC18（150．0mm×2．1mm，3μm）色谱柱；流速为0．2mL·min-1；柱温30℃；检测波长203nm；进样量1μL；以乙腈（A）和水（B）为流动相梯度洗脱：0rain（20％A）→10min（39％A）→12min（46％A）→15min（20％A）。结果：复方丹参片中三七皂苷R1、人参皂苷Rgl、人参皂苷Rbl分别在0．0216—0．4320μg、0．045—0．900μg、0．0302～0．6040μg范围内呈良好的线性关系；平均加样回收率分别为97．28％、97．58％、97．77％。结论：该方法高效、快速、准确，可为复方丹参片的质量控制提供参考。
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目的建立超高效液相色谱(UPLC)法测定三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量。方法采用ACQUITY BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm)色谱柱;流动相为乙腈-水,梯度洗脱;流速为0.4 mL.min-1;检测波长为203 nm;柱温为35℃;进样体积为2μL。结果三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1分别在0.116 8～1.168μg、0.123 6～1.236μg、0.030 0～0.300μg范围内与相应峰面积呈良好线性关系,平均加样回收率分别为100.1%、99.3%、99.9%,RSD值分别为0.4%、0.6%、1.0%(n=6)。结论较之HPLC法,UPLC法在不影响分离效果的情况下可大大提高三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的分析速度,改善分析效果;同时可减少溶剂的消耗。UPLC法可作为替代传统HPLC法的一种更为方便、快捷、可靠的方法。
[本文引用:0]
[9] 马双成. 药品检测新技术从HPLC到UHPLC[M].北京:人民卫生出版社,2012:92-94.
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人参皂苷Re
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含量测定
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