作者简介: 于洋(1980-),女,吉林吉林人,讲师,硕士,研究方向:卫生毒理学。电话:0432-64560167,E-mail:171880320@qq.com。
通信作者: 徐冶(1972-),男,吉林吉林人,教授,硕士生导师,博士,研究方向:病理学与组织胚胎学。电话:0432-64560371,E-mail:xuye_9707@163.com。
目的 观察大蒜素对 D-半乳糖致衰老小鼠心肌和肺组织氧化应激与细胞凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法 雄性昆明小鼠50只,按体质量随机分为正常对照组(C组)、模型对照组(D组)和大蒜素小剂量组(L组)、中剂量组(M组)、大剂量组(H组),每组10只。D、L、M、H组小鼠注射 D-半乳糖0.9%氯化钠溶液制备衰老模型,L、M和H组同时腹腔注射大蒜素注射液进行给药干预,共持续6周。通过小鼠转棒疲劳仪和小鼠跑台检测各组小鼠运动耐力;检测心肌和肺组织匀浆上清液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及总抗氧化力(T-AOC);免疫组织化学法观察凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达并统计二者比值变化。结果 行为学实验结果:与C组比较,D组小鼠在疲劳转棒上的停留时间和小鼠跑台上持续跑步时间均明显缩短( P<0.05),L、M、H组较D组有所延长;D组小鼠心肌和肺组织匀浆上清液中MDA含量较C组升高( P<0.05),SOD活性下降( P<0.05),T-AOC下降( P<0.05),L、M、H组较D组小鼠心肌和肺组织匀浆中MDA含量下降(均 P<0.05),SOD活性升高(均 P<0.05),T-AOC上升(均 P<0.05),且呈现一定剂量效应关系;免疫组化结果显示:D组小鼠较C组小鼠心肌Bax表达增强,Bcl-2表达减弱,L、M、H组小鼠Bax表达较D组减弱,Bcl-2表达较D组增强,肺组织两种蛋白表达趋势同心肌组织。结论 大蒜素对 D-半乳糖致衰老小鼠心脏和肺具有保护作用,具体表现为增加衰老小鼠心肺运动耐力、减轻心肌和肺局部组织过氧化水平,并减少心肌和肺组织内的细胞凋亡。
Objective To observe protective effects of allicin on heart and lung in aging mice induced by D-galactose,and try to explore the possible mechanism from the aspect of oxidative stress.Methods Fifty male Kunming mice were randomly divided into 5 groups:normal control group (group C),model control group (group D) and high-,middle-and low-dose of allicin groups (H,M,L group).The mice in group D,L,M and H were injected with D-galactose.At the same time,the mice in group L,M and H were injected with allicin.All of the injection lasted for 6 weeks.After that,athletic ability of the mice was evaluated by behavioral experiments.Malondialdehyde (MDA) content,superoxide dismutase (SOD) activity and total antioxidant capacity (T-AOC) in the homogenate of heart and lung tissues were measured,and the expression levels of Bax and Bcl-2 were tested in heart and lung.Results Behavioral experiment showed that standing time on Rota Rod System and continuous running time on mice treadmill were significantly shortened in group D as compared with group C ( P<0.05),but those were prolonged in the allicin groups.Compared with group C,MDA content in homogenate of myocardium and lung tissues was significantly increased in group D ( P<0.05),the activity of SOD was decreased ( P<0.05) and T-AOC was decreased ( P<0.05).As compared with group D,MDA content in allicin groups was significantly decreased ( P<0.05),SOD activity increased ( P<0.05) and A-TOC increased ( P<0.05) in a dose-dependent manner.The results of immunohistochemistry showed that the expression of Bax was significantly increased in group D as compared with group C,and the expression of Bcl-2 was decreased.After the intervention of allicin,expression of Bax was decreased in group L,M and H as compared with group D, and expression of Bcl-2 was increased as compared with group D.Expression levels of Bax and Bcl-2 in lung tissues showed the same changing trend.Conclusion Allicin has a potential protect role on heart and lung in D-galactose-induced aging mice by increasing athletic ability,decreasing oxidative stress and decreasing cell apoptosis of myocardium and lung tissues.
衰老是一种正常而复杂的生物学现象,随着机体衰老的逐渐进行,体内各组织器官的结构及功能均发生变化。目前,关于衰老原因,主要存在遗传学说、自由基学说及免疫学衰老学说等医学研究假说[1],无论哪种学说,对于衰老个体处在高氧化应激状态这一现象存在普遍的认可[2,3],当机体处于过氧化状态时,组织器官细胞自噬、凋亡甚至坏死增多,造成相应器官、系统功能失调甚至丧失[4,5,6]。因此,如果能够采取适当干预措施纠正过氧化状态,势必为保护衰老机体器官的功能完善和结构完整带来希望。大蒜素(allicin)是天然存在于百合科植物大蒜鳞茎中的三硫代烯丙醚类化合物,具有较强抗氧化作用,大量研究表明其具有较好抗菌、调血脂、降血糖及抗肿瘤等功能[7,8,9,10,11],但均是通过体外实验或在体的生化指标进行证明,关于大蒜素对衰老个体的作用尚未得到充分重视,故笔者参照文献[12]以 D-半乳糖复制经典小鼠衰老模型,联系系列氧化指标的检测判断大蒜素对衰老小鼠心脏和肺部氧化水平的影响,通过疲劳转棒与小鼠跑台实验检测行为学指标,观察大蒜素对衰老小鼠运动耐力的影响,探讨大蒜素对衰老小鼠个体心脏与肺的保护作用,这种将组织生化指标与行为学指标结合起来判断大蒜素对衰老个体心肺功能影响的切入方法在已有研究中尚不多见。另外,笔者在本研究还通过对局部心肌及肺组织凋亡相关蛋白表达变化的观察,初步探讨其中可能的机制,为寻找低毒高效性价比优越的天然抗衰老保健品提供理论及实验依据。
1.1.1 实验动物 清洁级雄性昆明小鼠,体质量(20±5) g,合格证号:20140415,购于吉林大学实验动物中心,实验动物生产许可证号:SCXK(吉)2012-0005,饲养于吉林医药学院科研实验室,室温(22±2) ℃,相对湿度55%~65%,实验动物饲养室动物使用许可证号:SYXK(吉)2012-0004。
1.1.2 主要试剂 D-半乳糖购于Sigma试剂公司(批号:1000873872);大蒜素注射液(2 mL:30 mg)购于广东罗浮山国药股份有限公司(批号:20130525);0.5%氯化钠注射液购于吉林省康乃尔药业有限公司(批号:20140118);丙二醛(MDA)检测试剂盒(批号:20130425)、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(批号:20130710)及T-AOC检测试剂盒(批号:20130926)购于南京建成生物工程研究所;所应用的一抗及二抗均购于Santacruz公司;二步法免疫组化检测试剂盒(批号:20140122)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.1.3 仪器 小鼠转棒式疲劳仪购于成都泰盟软件技术有限公司;小鼠实验跑台购于安徽正华生物仪器设备有限公司。
1.2.1 实验动物分组与衰老模型建立 所有小鼠购置后在本实验室适应性饲养1周,精确称定体质量。按体质量编号,采用随机数字表法将小鼠分为5组,即正常对照组(C组)和模型对照组(D组)、大蒜素小剂量组(L组)、大蒜素中剂量组(M组)和大蒜素大剂量组(H组),每组10只。D、L、M、H组按小鼠体质量以100 mg·kg-1的剂量皮下注射 D-半乳糖0.9%氯化钠溶液,C组皮下注射同体积0.9%氯化钠溶液,每日8:00注射1次,持续6周,各组均普通饲料喂养,建立衰老模型[12]。注射 D-半乳糖的同时,L、M和H组分别腹腔注射大蒜素10,20,和40 mg·kg-1,C组和D组同期腹腔注射同体积0.9%氯化钠溶液作对照处理,每日20:00注射1次,持续6周。
1.2.2 小鼠疲劳转棒实验 转棒式疲劳仪可用来观察动物的共济协调能力和运动耐力,衰老动物个体该方面能力会出现下降[13]。小鼠建立衰老模型后,将小鼠逆主轴转动方向放置,适应片刻,然后设置转速25 r·min-1,开始实验,记录小鼠在主轴上停留时间(stay time,ST),超过5 min记为5 min,以此作为疲劳转棒上ST。前2 d为适应期,之后开始正式实验,连测7 d。
1.2.3 小鼠跑台实验 小鼠实验跑台有多条跑道,跑道末端有通电的铁栅,启动时跑道皮带向后滚动迫使小鼠向前跑,若小鼠停止跑步,则尾部与通电铁栏端接触就会受到电击,如此强迫其持续跑步,直至力竭为止,此仪器用以检测小鼠运动耐力[14],以此间接观察各组小鼠心肺功能。实验时,设置转速12 m·min-1,将小鼠按顺序分别放入跑道,记录30 min内,被电击的次数以及持续跑步的时间,超过30 min者记为30 min。前2 d为小鼠适应期,之后开始正式实验,连测7 d。
1.2.4 心肌及肺组织匀浆上清液制备 处死小鼠后迅速取部分左心室心肌和部分肺组织,洗去残留血液,准确称定质量,分别按质量体积比1:9加预冷磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol·L-1,pH值=7.4)后以玻璃匀浆器在冰上充分研磨,再将匀浆液进行超声破碎,最后以5 000× g离心5 min,取上清液进行蛋白标定后备用。
1.2.5 小鼠心肌和肺组织匀浆上清液中MDA含量、SOD活性及T-AOC测定 取各组小鼠心肌和肺组织匀浆上清液,严格按照相应试剂盒操作步骤进行检测。
1.2.6 小鼠心肌及肺组织内凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达检测 各组小鼠心肌和肺组织用甲醛溶液固定并石蜡包埋后,制备石蜡切片,严格按照免疫组化试剂盒步骤进行操作,检测Bax和Bcl-2表达。
1.2.7 统计学方法 应用SPSS13.0版软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(
各组小鼠疲劳转棒实验结果显示,与C组比较,D组小鼠在主轴上ST明显缩短( t=-3.21, P<0.05),而大蒜素各组ST较D组明显延长( t=6.12, P<0.05),且H组ST长于L组( t=4.80, P<0.05);小鼠跑台结果显示,与C组比较,D、L、M、H组小鼠持续跑步时间缩短( t=-7.32,-8.15,-4.67,-6.22, P<0.05),受电击次数增加( t=10.20,5.85,7.63,8.21, P<0.05),与D组比较,M、H组小鼠持续跑步时间延长( t=3.57,6.36, P<0.05),受电击次数减少( t=-5.52,-4.21, P<0.05),且H组持续跑步时间长于L组( t=5.88, P<0.05),受电击次数减少( t=-3.22, P<0.05)。表明大蒜素各组衰老小鼠运动耐力强于D组衰老小鼠,实验结果见表1。
与C组比较,D组小鼠心肌和肺组织匀浆上清液中MDA含量升高( t=11.32,5.28, P<0.05),SOD活性下降( t=-5.15,-2.98, P<0.05),T-AOC降低( t=-8.10,-5.68, P<0.05);与D组比较,M、H组心肌组织匀浆上清液中MDA含量减少( t=-4.15,-8.21, P<0.05),SOD活性升高( t=5.21,7.84, P<0.05),T-AOC升高( t=2.31,4.28, P<0.05),且H组SOD活性及T-AOC高于L组( t=8.27,2.14, P<0.05);相较于D组,M、H组小鼠肺组织匀浆上清液中MDA
含量减少( t=-5.27,-8.69, P<0.05),SOD活性升高( t=6.58,10.22, P<0.05),T-AOC升高( t=8.69,6.87, P<0.05),L组各项指标变化不明显( P>0.05),H组小鼠肺组织匀浆上清液中MDA含量低于L组( t=-4.58, P<0.05)、SOD活性及T-AOC高于L组( t=12.27,6.38, P<0.05)。以上结果说明大蒜素能够减轻衰老小鼠心肌及肺部脂质过氧化,增强局部抗氧化能力,实验结果见表2。
目前关于细胞代谢过程中产生的大量具有强氧化性的自由基可以引起机体衰老的学说得到了较为广泛的认可[15]。正常生理情况下,机体内部抗氧化与氧化能力之间可以保持动态平衡,但衰老个体,这种平衡却被打破,机体长期处于过氧化状态[16],本实验通过对MDA、SOD及T-AOC系列氧化指标检测发现 D-半乳糖致衰老小鼠心肌和肺部均处于过氧化状态,大蒜素的干预能够一定程度上缓解这种氧化与抗氧化的失衡。
过氧化状态导致的体内氧化应激不仅仅表现在氧化指标的单纯改变,同时也带来一些后续病理性改变,例如诱导相应组织器官细胞发生自噬、凋亡、坏死等[17],细胞发生凋亡的信号通路之一是通过Bcl-2结合并失活促凋亡家族成员中具有破坏线粒体膜完整性功能的Bax来调控的,当Bcl-2磷酸化或受凋亡因素刺激时,Bax从与Bcl-2的结合体中释放出来,发挥促凋亡的功能[18]。所以Bax表达增强、Bcl-2表达减弱,结合Bax/Bcl-2比值升高,说明凋亡情况明显。本实验以免疫组化法观察各组小鼠心肌和肺凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达,分析二者表达水平的灰度值比值,发现D组衰老小鼠心肌和肺Bax/Bcl-2比值较C组明显升高,说明D组衰老小鼠心肌和肺组织细胞发生明显凋亡,而经大蒜素干预的L、M、H组小鼠该比值较D组下降则说明大蒜素能够减轻衰老小鼠心肌和肺组织细胞凋亡的发生。
通过小鼠疲劳转棒和小鼠跑台两项行为学实验,笔者发现大蒜素能够增强衰老小鼠运动耐力,并呈现一定的剂量效应关系,一般认为心肺功能与小鼠的运动耐力呈正相关[19],运动耐力的强弱能够间接体现心肺功能的优差。本研究中大蒜素的干预对于衰老小鼠运动耐力的提升,间接证明大蒜素能够保护衰老小鼠心肺功能的减退。说明大蒜素对衰老小鼠心脏和肺功能衰退具有一定拮抗作用。
综上所述,笔者发现 D-半乳糖致衰老小鼠的心肌和肺处于高氧化应激状态,器官组织细胞线粒体凋亡途径激活,运动耐力下降,大蒜素的干预能够明显降低局部过氧化水平,降低Bax/Bcl-2比值,减少器官内细胞凋亡,并增强衰老小鼠运动耐力。说明大蒜素通过降低衰老小鼠心脏和肺部氧化应激水平并减少器官内细胞凋亡实现对衰老个体心肺功能的保护作用,为扩展大蒜素的临床应用及扩宽抗衰老研究思路提供了实验依据。
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