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刘敏, 余乐, 李水福, 李伟根. 可变波长高效液相色谱法同时测定地稔中没食子酸和鞣花酸的含量* [J]. 医药导报, 2016,35(2): 180-183
Min LIU, Le YU, Shuifu LI, et al. Determination of Gallic Acid and Ellagic Acid in Melastoma dodecandrum by HPLC with Variable Wavelength [J]. HERALD OF MEDICINE,2016,35(2): 180-183  
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可变波长高效液相色谱法同时测定地稔中没食子酸和鞣花酸的含量*
刘敏1, 余乐1, 李水福1, 李伟根2
1.浙江省丽水市食品药品检验所,丽水 323000
2.浙江省松阳县中医院药剂科,丽水 323400

作者简介: 刘敏(1983-),女,浙江丽水人,主管中药师,硕士,研究方向:中药质量控制及分析等。电话:0578-2138744,E-mail:2001lm2005@163.com。

收稿日期: 2014-11-04 修回日期: 2015-01-08
基金: *浙江丽水市公益性技术应用项目(2014JYZB05);
摘要

目的 建立地稔中没食子酸和鞣花酸的含量测定方法。方法 应用高效液相色谱法测定,色谱柱为Waters Xbidge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为甲醇(A)-混合水溶液(含磷酸0.3%和四氢呋喃0.06%)(B),梯度洗脱:0~12 min,1% A(检测波长216 nm);12~24 min,1% A→55% A(检测波长254 nm);流速1.0 mL·min-1,柱温30 ℃。结果 没食子酸和鞣花酸的线性范围分别为0.089 7~0.448 0 μg( r=0.999 8),0.028 4~0.142 0 μg( r=0.999 8);平均加样回收率分别为96.51%(RSD=1.10%),96.58%(RSD=1.48%)。结论 该方法操作简便、结果准确、重复性好,可用于畲药地稔中没食子酸和鞣花酸的含量测定,为地稔的质量控制提供了一定的依据。

关键词: 地稔; 没食子酸; 鞣花酸; 色谱法; 高效液相; 波长; 可变
中图分类号:R927.2 文献标志码:B 文章编号:1004-0781(2016)02-0180-04 doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2016.02.020
Determination of Gallic Acid and Ellagic Acid in Melastoma dodecandrum by HPLC with Variable Wavelength
Min LIU1, Le YU1, Shuifu LI1, Weigen LI2
1.Institute for Food and Drug Control of Lishui City, Zhejiang Province,Lishui 323000,China
2.Department of Pharmacy,the Hospital of Traditional Chinese Medicine of Songyang County,Zhejiang Province, Lishui 324000,China
Abstract

Objective To establish a high performance liquid chromatographic (HPLC) method for determination of gallic acid and ellagic acid in Melastoma dodecandrum.Methods HPLC was applied, the chromatographic column was Waters Xbidge C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm);with methanol-mixed aqueous solution containing 0.3% phosphoric acid and 0.06% tetrahydrofuran as the mobile phrase;gradient elution:0-12 min,1% A (the detection wavelength was 216 nm);12-24 min,1% A→55% A (the detection wavelength was 254 nm);flow rate was 1.0 mL·min-1, the column temperature was 30 ℃.Results Good linear relationship of gallic acid and ellagic acid was obtained at ranges of 0.089 7-0.448 0 μg ( r=0.999 8) and 0.028 4-0.142 μg ( r=0.999 8),respectively.The average recoveries were 96.51% (RSD=1.10%) and 96.58% (RSD=1.48%).Conclusion The method is simple,accurate and repeatable,and it is suitable for content determination of gallic acid and ellagic acid in Melastoma dodecandrum.It provides a basis for quality evaluation of Melastoma dodecandrum.

Keyword: Melastoma dodecandrum; Gallic acid; Ellagic acid; Chromatography; high performance liquid; Wavelength; variable

地稔为野牡丹科植物地稔( Melastoma dodecandrum Lour.)的全草,畲族人民多称嘎狗噜或粪桶板,又名山地稔、地葡萄、金头石榴、铺地锦、落地稔、地茄等,分布于长江以南的江西、福建、浙江、广西、广东、贵州、云南等省,汉族、瑶族、畲族等民族民间使用较广泛[1,2]。《广东药材标准》和《浙江省中药炮制规范》2005年版正式收载该药,特别是《浙江省中药炮制规范》以畲药的名义收载,是极具开发前景的天然药物。临床用于治疗高热、肿痛、咽喉肿痛、牙痛、赤白血痢疾、黄疸、水肿、痛经、崩漏、带下、疔疮、毒蛇咬伤等病症[3]。研究表明,地稔含有多糖、黄酮类、氨基酸、酚类、常量和微量元素、色素等多种化学成分,具有止血、抗氧化、抑制糖基化终末产物的生成、镇痛抗炎、降糖等作用[4,5,6]。没食子酸是一种多酚类化合物,具有抗菌、抗病毒等作用,鞣花酸是一种植物多酚类化合物,具活血化瘀、阻断致癌物致癌、抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成和抗氧化等作用,其对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用,具有强力祛癌变功效[7,8,9]。目前,已有学者采用高效液相色谱(HPLC)法对珠子草、野老鹳草等具有抗菌抗炎作用药材中没食子酸、鞣花酸的含量进行测定[10,11],地稔中没食子酸、鞣花酸的含量测定,不仅为该药材在抗氧化方面的作用提供进一步的药理依据,而且拓宽地稔的应用范围,为抗肿瘤药物的开发提供了新的选择和思路。因此,准确测定地稔中没食子酸和揉花酸的含量,能为地稔的质量控制和开发应用提供更全面的科学依据。

1 仪器与试药
1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);XS105DU电子天平(梅特勒-托利多仪器公司,感量:0.01 mg)。

1.2 试药

地稔药材[分别采自丽水市莲都区(批号:140519,140618,140718)、丽水市云和县(批号:131116,140524,140621),阴干,经浙江省丽水市食品药品检验所李水福主任中药师鉴定为野牡丹科植物地稔( Melastoma dodecandrum Lour.)];没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110831-201204,含量:89.9%),鞣花酸对照品(成都普菲德生物技术有限公司,批号:130922,含量≥99%)。甲醇、磷酸、四氢呋喃、二甲亚砜为色谱纯,水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果
2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Xbidge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为甲醇(A)-混合水溶液(含磷酸0.3%和四氢呋喃0.06%)(B),梯度洗脱:0~12 min,1% A(检测波长为216 nm);12~24 min,1% A→55% A,检测波长254 nm;流速1.0 mL·min-1,柱温30 ℃。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品19.96 mg,置于20 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度制成每毫升含没食子酸897 μg 的溶液,精密移取上述溶液2 mL置20 mL量瓶中,用10%盐酸稀释至刻度即得每毫升含没食子酸89.7 μg的溶液。精密称取鞣花酸对照品14.20 mg,置于50 mL量瓶中加二甲亚砜稀释至刻度制成每毫升含鞣花酸284 μg 的溶液,精密移取上述溶液2 mL置20 mL量瓶中,用二甲亚砜稀释至刻度即得每毫升含鞣花酸28.4 μg的溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取经粉碎、过三号筛的地稔饮片(批号:140618)粉末0.2 g(同时另取本品测定水分)置锥形瓶中,精密加入10%盐酸100 mL,密塞,称定质量,水浴加热回流提取4 h,放冷至室温,再称定质量,用提取溶剂补足减失的质量,摇匀,滤过,滤液用孔径0.45 μm的微孔滤膜滤过,滤液即为供试品溶液。

2.4 系统适应性实验

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样,记录色谱图,见图1。在该色谱条件下,没食子酸、鞣花酸与其他成分可达到基线分离,分离度均>1.5。对照品与供试品相对应色谱峰的紫外光谱吸收均一致。结果表明,在上述色谱条件下没食子酸和鞣花酸具有良好的分离效果。

2.5 线性关系考察

2.5.1 没食子酸线性关系考察 分别精密量取89.7 μg·mL-1没食子酸对照品溶液1,2,3,4,5 μL注入液相色谱仪,测定峰面积,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,作标准曲线,并以最小二乘法计算得回归方程: Y=8 696.9 X+23.107, r=0.999 8,结果显示进样量在0.089 7~0.448 0 μg范围内有良好的线性关系。

图1 对照品和供试品溶液的HPLC图A.没食子酸对照品;B.鞣花酸对照品;C.供试品;1.没食子酸;2.鞣花酸Fig.1 HPLC chromatograms of the solution of control and sampleA.control of gallic acid;B.control of ellagic acid;C.Melastoma sample;1.gallic acid;2.ellagic acid

2.5.2 鞣花酸线性关系考察 分别精密称取28.4 μg·mL-1鞣花酸对照品溶液1,2,3,4,5 μL注入液相色谱仪,测定峰面积,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,作标准曲线,并以最小二乘法计算得回归方程: Y=9 933.3 X+20.164, r=0.999 8,结果显示进样量在0.028 4~0.142 0 μg范围内有良好的线性关系。

2.6 精密度实验

精密吸取供试品溶液5 μL,连续进样6次,测得其峰面积,计算没食子酸峰面积的RSD为0.29%( n=6),鞣花酸峰面积的RSD为0.94%( n=6),结果显示精密度良好。

2.7 稳定性实验

精密吸取“2.3”项制备的供试品溶液各5 μL,分别在0,2,4,6,8,10,24 h依次进样,测得其峰面积,计算没食子酸峰面积的RSD为0.32%( n=7),鞣花酸峰面积的RSD为1.92%( n=7),结果表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.8 重复性实验

精密称取同一地稔饮片(批号:140618)粉末6份,照“2.3”项制备,进样5 μL测定含量,按干燥品计算,没食子酸和鞣花酸的含量分别为26.31 mg·g-1,6.26 mg·g-1,RSD分别为0.29%,1.74%( n=6)。

2.9 加样回收率实验

取已知含量的地稔饮片(批号:140618)6份,各约0.1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别精密加入没食子酸、鞣花酸对照品溶液1 mL,按“2.3”项方法,制备供试品液,进样5 μL,测定没食子酸和鞣花酸含量,计算回收率,结果没食子酸平均回收率96.51%,RSD=1.10%,鞣花酸平均回收率96.58%,RSD=1.48%见表1。

表1 没食子酸和鞣花酸加样回收率实验结果 Tab.1 Result of recovery of gallic acid and ellagic acid
2.10 样品含量测定

取不同批号的样品粉末(阴干,过三号筛)约0.2 g,各两份,精密称定,按“2.3”项方法制备供试品溶液,分别测定并计算含量(按干燥品计算)。结果见表2。

表2 地稔中没食子酸和鞣花酸的含量测定结果 Tab.2 Content determination of gallic acid and ellagic acid in melastoma dodecandrum n=2
3 讨论

采用二极管阵列检测器在波长190~600 nm分别扫描对照品及供试品试液中没食子酸、鞣花酸的紫外吸收,结果发现没食子酸在波长216,273 nm处有最大吸收,鞣花酸在波长254 nm处有最大吸收,两者几乎无交叉吸收区域。根据各成分保留时间的差异,在0~12 min设定测定波长为216 nm测定没食子酸,12 min以后以波长254 nm测定鞣花酸。采用可变波长检测,进一步提高了检测的灵敏度。

地稔中含与没食子酸极性非常接近的一个成分,只有加入适量四氢呋喃,才能将该成分与没食子酸分离,通过比较流动相中不同比例四氢呋喃(0.04%,0.05%,0.06%,0.1%)和不同比例磷酸(0.2%,0.3%,0.4%,0.5%)、以及甲醇的混合效果,结果发现以流动相为甲醇(A)-混合水溶液(含磷酸为0.3%和四氢呋喃0.06%)(B),梯度洗脱,效果最佳;而且比较多个品牌的酸性色谱柱,结果以Waters的酸性色谱柱分离最佳。

鞣花酸的制备方法主要有酸水解法、直接提取法、倍酸(或其酯)的氧化聚合法及单宁酸氧化法。没食子酸多以鞣质的形式存在于地稔中。采用酸水解法能将两成分进行有效的提取分离。笔者曾考察盐酸浓度、提取时间、溶剂用量对提取的影响,采用正交实验,以两成分含量为综合指标,经方差分析得出,最佳水解条件为10%盐酸100 mL,水浴加热提取4 h。

因没食子酸、鞣花酸的溶解性有较大的差异。鞣花酸在甲醇、50%甲醇、酸水液中的溶解度较小,在二甲亚砜中有较大的溶解度,故以二甲亚砜为溶剂配制鞣花酸对照品,并单独进样。

本课题相关研究表明[12],地稔中没食子酸、槲皮素含量随干燥温度降低而显著升高,以室内阴干效果为最好。故而本研究所采用的样本,为阴干处理后的地稔饮片。

杨丹等[13]研究发现地稔中含4- O-β-D-吡喃葡萄糖基-3,3,'4-'三甲氧基鞣花酸,但笔者尚未见地稔中鞣花酸含量测定的相关报道,也未见地稔中鞣花酸药理相关研究的报道。本研究采用HPLC同时测定地稔药材中没食子酸和鞣花酸的含量,为制定地稔质量标准和对地稔的进一步开发利用提供科学依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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