Xueling ZHANG, Xiaoqiu YU, Yue ZHANG, et al. Determination of Three Kinds of Related Substance in Mesalazine Sustained Release Granules by Gas Chromatography[J]. HERALD OF MEDICINE,2016,35(2): 184-187
作者简介: 张雪玲(1971-),女,齐齐哈尔人,副主任药师,学士,主要从事医院药学工作。电话:0452-2739694,E-mail:zhangxueling@163.com。
通信作者: 王超众(1983-),男,齐齐哈尔人,副主任药师,硕士,主要从事药物分析工作。电话:0452-2798729,E-mail:wangchaozhongkcn@163.com。
目的 建立气相色谱法测定美沙拉嗪缓释颗粒中苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚三种有关物质的含量。方法 采用安捷伦HP-5 (10 m×0.53 mm,2.65 μm)毛细管柱,载气为高纯氮气,流速15 mL·min-1,氢火焰离子检测器(FID),进样口温度280 ℃,进样量4 μL,检测器温度300 ℃,程序升温(起始温度70 ℃,保持2 min,以10 ℃·min-1的速率升温至150 ℃,维持6 min 。结果 3个杂质分离度良好。苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚的回收率在 98.04%~103.00%。精密度、线性回归等良好。结论 该方法能用于美沙拉嗪缓释颗粒的质量控制。
Objective To establish a gas chromatography (GC) method for determination of aniline,2-aminophenol and 4-aminophenol in mesalazine sustained release granules.Methods Agilent HP-5 (10 m×0.53 mm,2.65 μm) capillary GC column was adopted.The carrier gas was high purity nitrogen at a flow rate of 15 mL·min-1.The inlet temperature was controlled at 280 ℃ and the FID detector temperature was 300 ℃.The oven temperature was initially held at 70 ℃ for 2 min and was then programmed to 150 ℃ at 10 ℃·min-1 and held for 6 min.Results A good resolution was obtained between the peaks of the three impurities at chromatographic conditions above.The recoveries of aniline,2-aminophenol and 4-aminophenol were among 98.04% to 103.00%.The precision and linearity equations were good.Conclusion The method can be adopted for the quality control of mesalazine sustained release granules.
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种非特异性炎症性肠病,其特点是病程长,反复发作,迁延不愈,难以根治,是目前公认的较难治愈的疾病之一[1,2]。美沙拉嗪为国家二类抗炎新药,口服后疗效好,毒副作用小,作用时间长,主要用于治疗溃疡性结肠炎[3]。苯胺是美沙拉嗪合成的主要原料[4],而且美沙拉嗪久置也会产生2-氨基苯酚、4-氨基苯酚等降解产物[5],这3种物质均无疗效且有较大毒性[6],该药临床不良反应也时有发生[7]。曾有文献报道用高效液相色谱(HPLC)法测定美沙拉嗪控释胶囊中的3-氨基水杨酸杂质[2]以及用离子对RP-HPLC法检测美沙拉嗪栓中4-氨基苯酚、2,5-二羟基苯甲酸杂质[8],但测定苯胺、2-氨基苯酚两杂质笔者尚未见文献报道。笔者建立气相色谱(GC)法同时测定美沙拉嗪缓释颗粒中苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚3种有关物质的含量,并进行方法学验证,为美沙拉嗪缓释颗粒质量标准的提高提供依据。
Agilent 7890A气相色谱仪(美国安捷伦),Agilent G4513A自动进样器,Agilent GC ChemStation工作站,Sartorius BP221S电子天平(德国赛多利斯,感量:0.1 mg)。
美沙拉嗪对照品(中国食品药品检定研究院,批号:100565-200701);苯胺(AccuStandard,批号:16712);2-氨基苯酚(AccuStandard,批号:16654);4-氨基苯酚(USP REFERENCE STANDARD,批号:1021204);二氯甲烷(DikmaPure,色谱纯,批号:6243632);美沙拉嗪缓释颗粒(上海某制药厂,规格:每粒0.5 g,批号:140701,140702,140703);空白辅料由黑龙江某药厂提供。
安捷伦HP-5(5%Ph Me Silicone)色谱柱(10 m×0.53 mm,2.65 μm),载气为氮气(纯度99.999%),流速为15 mL·min-1,程序升温:起始温度为70 ℃,维持2 min,以10 ℃·min-1的速率升温至150 ℃,维持6 min,进样口温度为280 ℃,检测器温度为300 ℃,不分流进样,进样量4 μL。
2.2.1 对照品贮备液 精密称取苯胺12.5 mg,置10 mL量瓶中,加二氯甲烷溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取2 mL,置50 mL量瓶中,加二氯甲烷稀释至刻度,摇匀,作为苯胺贮备液(50 μg·mL-1)。分别精密称取2-氨基苯酚、4-氨基苯酚20 mg,置10 mL量瓶中,加二氯甲烷溶解并稀释至刻度,摇匀,作为2-氨基苯酚、4-氨基苯酚贮备液(2 mg·mL-1)。
2.2.2 杂质对照品溶液 分别精密量取上述贮备液1 mL,置同一个100 mL量瓶中,加二氯甲烷稀释至刻度,摇匀,滤过,作为杂质对照品溶液(分别含苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚0.5,20,20 μg·mL-1)。
2.2.3 供试品溶液 取美沙拉嗪缓释颗粒内容物适量,研细,精密称取适量(相当于美沙拉嗪1.0 g),置10 mL量瓶中,加二氯甲烷溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液。
2.2.4 美沙拉嗪溶液 精密称取美沙拉嗪对照品1 g,置10 mL量瓶中,加二氯甲烷溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,作为美沙拉嗪溶液。
2.2.5 空白辅料溶液 精密称取空白辅料适量(相当于4粒处方量),置10 mL量瓶中,加二氯甲烷溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,作为空白辅料溶液。
2.3.1 分离度实验 分别精密量取杂质对照品溶液、供试品溶液、美沙拉嗪溶液、空白辅料溶液、二氯甲烷溶液各4 μL,按照“2.1”项色谱条件进样分析,记录色谱图,见图1。由图1可知,1 min前为二氯甲烷峰,10 min后为辅料峰,美沙拉嗪没有峰,3个杂质峰在2.5~7.5 min内出现,且在该色谱条件下,各杂质之间分离度均>2.0。
2.3.2 破坏实验 分别取供试品粉末适量:于150 ℃的烘箱中放置5 h,放冷;于4 000 lx光线下放置7 d;加5 mol·mL-1盐酸溶液适量,破坏2 h,中和,挥干;加5 mol·mL-1氢氧化钠溶液适量,破坏2 h,中和,挥干;加3%过氧化氢溶液适量,破坏2 h,挥干。按“2.2.3”项供试品溶液配置方法配制溶液,进样分析。结果在该条件下,酸、碱破坏时,2-氨基苯酚和4-氨基苯酚有所增加,苯胺无变化。而在加热、光照、氧化破坏时上述三种杂质均未增高,见图2。该实验表明:美沙拉嗪在不当的储存环境会产生2-氨基苯酚和4-氨基苯酚等杂质,应正确、合理的储存,保证该药品的质量。
精密量取苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚对照品贮备液适量,分别用二氯甲烷稀释成含苯胺浓度为0.100 46,0251 5,0.502 3,1.004 6,2.009 2 μg·mL-1;含2-氨基苯酚0.100 5,1.005,10.05,40.18,80.36 μg·mL-1;含4-氨基苯酚0.100 1,1.001,10.01,40.02,80.04 μg·mL-1系列浓度的混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件,分别进样分析。以各成分浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,各成分回归方程和线性范围见表1。由结果可见各成分在各自线性范围内线性关系良好。
 | 图1 杂质对照品(A)、供试品(B)、美沙拉嗪(C)、空白辅料(D)、二氯甲烷(E)溶液气相色谱图1.苯胺;2.2-氨基苯酚;3.4-氨基苯酚Fig.1 GC chromatograms of impurity reference substances(A),testing sample(B),mesalazine(C),excipients(D),dichloromethane (E)1.aniline;2.2-aminophenol;3.4-aminophenol |
 | 图2 供试品热破坏(A)、光破坏(B)、酸破坏(C)、碱破坏(D)、氧化破坏(E)气相色谱图1.苯胺;2.2-氨基苯酚;3.4-氨基苯酚Fig.2 GC chromatograms of thermal destruction (A), light destruction (B), acid destruction (C), alkali destruction (D) and oxidative destruction (E)1.aniline;2.2-aminophenol;3.4-aminophenol |
 | 表1 3种成分回归方程及线性范围 Tab.1 Regression equation and linear range of three components |
精密吸取杂质对照品溶液4 μL,注入气相色谱仪,连续进样6次,结果苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚峰面积RSD分别为0.82%,0.47%,0.66%。
取同一批号供试品,按“2.2.3”项方法平行配制6份供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样分析,结果苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚含量RSD分别为1.34%,1.27%,1.10%。
取供试品溶液,分别于0,1,2,4,6,8 h,按“2.1”项色谱条件进样分析,结果表明供试品溶液在8 h内稳定。
精密称取已测得有关物质含量的供试品粉末适量(相当于美沙拉嗪1.0 g),分别置9个10 mL量瓶中,分别精密加入稀释成适当浓度的混合对照品溶液,用二氯甲烷稀释至刻度,制备低、中、高浓度的回收率实验用供试溶液,按“2.1”项色谱条件测定。结果见表2。
| 表2 苯胺、2-氨基苯酚和4-氨基苯酚加样回收率实验结果 Tab.2 Results of recovery of aniline,2-aminophenol and 4-aminophenol |
精密量取对照品贮备液,用二氯甲烷逐级稀释,按“2.1”项色谱条件进样分析,记录色谱图。以信噪比为3:1时为检测限,苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚浓度均为0.015 μg·mL-1;以信噪比为10:1时为定量限,苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚浓度均为0.05 μg·mL-1。
精密量取杂质对照品溶液和供试品溶液各4 μL,分别进样,记录色谱图,按外标法以峰面积计算供试品中苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚的含量。结果见表3。由结果可见自制的3批美沙拉嗪缓释颗粒中均含有该3种杂质,因此有必要建立此方法以控制该样品质量,标准限度分别为5 ppm,200 ppm,200 ppm。
| 表3 3批供试品有关物质测定结果 Tab.3 Determination on related substance in three batches of samples ppm |
在《英国药典》(BP2013)的美沙拉嗪、美沙拉嗪缓释片和美沙拉嗪缓释胶囊标准中,均对上述3种杂质进行有关物质检测,BP2013采用两个液相系统分别对苯胺和2-氨基苯酚、4-氨基苯酚进行检测[9]。《欧洲药典》(EP8.0)只收载美沙拉嗪标准,方法与BP2013美沙拉嗪基本一致[10]。《美国药典》(USP35)采用气相色谱法对该3种杂质进行检测[11]。我国现行的美沙拉嗪缓释颗粒标准中未对有关物质进行检测[12]。
BP2013和EP8.0对该3种杂质的限量分别为10 ppm,200 ppm,200 ppm,USP35更低一些,为5 ppm,200 ppm,200 ppm。苯胺在《有毒有害物质分类参考》中属高毒物质,必须将其含量控制在一个较低的安全的范围之内,因此本研究采用限度较低的5 ppm,200 ppm,200 ppm作为标准限度。
笔者比较氦气和氮气两种载气,结果实验结果差别不大,而氮气更廉价更普及,因此采用氮气作为载气。比较无水乙醇和二氯甲烷两种溶剂,结果乙醇的供试品溶液稳定性较差,因此采用二氯甲烷作为溶剂。
本实验建立气相色谱测定法,经方法学考察,表明该方法准确、可靠,可用于美沙拉嗪缓释颗粒中苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚的有关物质检查,且在3批样品中均检出上述3种杂质,因此有必要对其进行控制。
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