.[J]. HERALD OF MEDICINE,2016,35(2): 188-190
作者简介: 郭晓敏(1964-),女,河南洛阳人,副高级工程师,学士,主要从事药品的微生物检验及方法学验证工作。电话:(0)15927067161,E-mail:1728026988@qq.com。
目的 建立更昔洛韦眼用凝胶的无菌检查方法,保证检验结果的准确性和可靠性。方法 依据《中华人民共和国药典》2010年版二部要求采用薄膜过滤法进行更昔洛韦眼用凝胶的无菌检查,并进行方法学验证。结果 样品管无菌生长,6株阳性对照菌生长良好。结论 更昔洛韦眼用凝胶无菌检查可采用薄膜过滤法。
更昔洛韦是核苷类抗病毒药,具有广谱、高效、安全的抗病毒特性,适用于防治疱疹属病毒感染。更昔洛韦眼用凝胶作为眼用制剂,《中华人民共和国药典》2010年版二部规定需做无菌检查。本品为多剂量包装的滴眼剂,为避免外源性污染对使用者造成的危害,加入一定量的苯扎溴铵作为抑菌剂。苯扎溴铵为季胺类化合物,阳离子表面活性剂,对革兰阳性菌有较强的作用[1]。因此无菌检查时必须选择适宜的方法消除其抗菌作用,才能保证检验结果的准确性和可靠性。无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法[2],因更昔洛韦眼用凝胶中含有较多的赋形剂,在溶液中形成胶状物质,所以不易通过孔径0.45 μm滤膜。采用薄膜过滤法对凝胶类制剂进行无菌检查,笔者未见文献报道。笔者采用两种方法对更昔洛韦眼用凝胶的无菌检查进行方法筛选,并选择破乳剂使样品经过破乳后,采用薄膜过滤法进行更昔洛韦眼用凝胶的无菌检查,并进行方法学验证。
HTY-2000A型智能集菌仪及DGB/330全封闭式无菌过滤培养器(杭州泰林生物技术设备有限公司);LMQ.R型立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司);生物安全柜(苏州净化设备有限公司);GNP-9270BS-Ⅲ隔水式恒温培养箱(30~35 ℃,上海新苗医疗器械制造有限公司);SPX-500型生化培养箱(23~28 ℃,宁波东南仪器有限公司)。
更昔洛韦眼用凝胶。规格为5 g:7.5 mg,批号:130501,130502,130503,均由湖北科益药业股份有限公司提供。
硫乙醇酸盐流体培养液、改良马丁培养液、营养肉汤培养液、营养琼脂培养液,均由北京三药科技开发公司提供。培养液在使用前均已做过培养液适用性检查。0.1%蛋白胨水溶液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液均由本实验室自制。
枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501],[细菌(bacteria,B)],金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003],大肠埃希菌[CMCC(B)44102],生孢梭菌[CMCC(B)64941],白念珠菌[CMCC(F)98001;真菌(fungus,F)],黑曲霉[CMCC(F)98003],均来自中国食品药品检定研究院中国医学细菌保藏管理中心。
参照文献[2]。取经32~33 ℃培养20 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1 mL,生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1 mL;取经25~26 ℃培养24 h的白念珠菌改良马丁液体培养物1 mL,分别加入到0.9%无菌氯化钠溶液9 mL中,10倍稀释至10-5~10-6含菌数<100 cfu·mL-1的菌悬液备用。取经25~26 ℃培养1周的黑曲霉斜面培养物,加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液3~5 mL,将孢子洗脱,然后吸出孢子悬液,用垫有脱脂棉的漏斗(湿热灭菌)过滤,除去菌丝,收集孢子悬液至另一无菌试管内作为菌悬液,取此孢子悬液,用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含孢子数小于100 cfu的孢子悬液备用。
每种菌液接种2个平皿,取其平均值。取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌液各1 mL注入营养琼脂培养液15~20 mL,32~33 ℃培养24 h,计数;取白念珠菌、黑曲霉菌液各1 mL注入改良马丁琼脂培养液15~20 mL,25~26 ℃培养72 h,计数。生孢梭菌计数采用硫乙醇酸盐流体培养液试管法,32~33 ℃培养24 h,计数。
取每支装量为20 mL的硫乙醇酸盐流体培养液8管,分别接入<100 cfu的金黄色葡萄球菌 、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管。取每支装量为20 mL改良马丁培养液4管,分别接入<100 cfu白念珠菌、黑曲霉菌液各2管。其中1管接入更昔洛韦眼用凝胶(批号:130501,样品与培养液的比例为1:20) 1 g振摇,使其充分分散,作为实验组,另一支作为对照组,按规定温度将上述各管培养3~5 d。结果见表1。结果表明:大肠埃希菌、生孢梭菌、白念珠菌、黑曲霉各实验组和对照组均生长良好,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的对照组均生长良好,而实验组均未有菌生长,说明更昔洛韦眼用凝胶对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑制作用,不宜采用直接接种法,需采用薄膜过滤法进行验证。
 | 表1 更昔洛韦眼用凝胶无菌检查直接接种法方法学验证结果 |
供试液制备:以无菌操作取样品5 g(5 g样品作为1份,共取6份),于无菌200 mL输液瓶中,加入5%硫酸镁溶液10 mL,振摇使样品破乳,然后加入0.1%蛋白胨溶液至100 mL,振摇使样品充分分散,即得供试液[2]。
取一组DGB220全封闭集菌培养器,先用0.1%蛋白胨溶液约20 mL润湿滤膜,在一管中先泵入培养液并夹紧管口,再将含有供试品5 g的供试液按薄膜过滤法滤至另一管,滤过后不用冲洗直接泵入相同培养液,于两管中分别接入<100 cfu的实验菌。前者作为阳性对照组(菌液+培养液),后者作为实验组(供试品+
菌液+培养液)。另取一组DGB220全封闭集菌培养器滤过0.1%蛋白胨水溶液200 mL,然后分别加入硫乙醇酸盐流体培养液和改良马丁培养液各100 mL,密封作为阴性对照,轻轻摇动各培养液管,使供试品、菌液与培养液混合均匀,各实验菌同法操作。硫乙醇酸盐流体培养液管置32~33 ℃、改良马丁培养液管置25~26 ℃培养箱培养3~5 d,培养期间逐日观察。验证实验取3个批号的样品进行3次实验,结果见表2,3。
| 表2 3批样品菌液计数结果 |
| 表3 更昔洛韦眼用凝胶无菌检查薄膜过滤法方法学验证结果 |
结果表明:在3次验证实验中,阴性对照组均未长菌,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的实验组菌生长速度和对照组相比没有明显差异,均在18~24 h内变混浊。白念珠菌、黑曲霉实验组均在第2天出现明显的混浊,呈阳性。说明如果样品污染了以所用的6种实验菌为代表的菌类,按现行的无菌检查法即可检出。
取供试品30支,每支取样量为500 mg,以无菌操作取15 g置于无菌的500 mL输液瓶中,加入5%硫酸镁溶液30 mL,振摇使样品破乳,然后加入0.1%蛋白胨溶液至300 mL使样品充分分散,即得供试液。取一组DGB330全封闭集菌培养器,按薄膜过滤法,先用0.1%蛋白胨溶液约30 mL润湿滤膜,然后将供试液全部通过滤膜,供试液经薄膜过滤后不需冲洗,2管加入硫乙醇酸盐流体培养液,其中1管中加入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌,作为阳性对照管,第3管加入改良马丁培养液,按规定温度培养14 d,逐日观察,供试品管均澄清,阳性对照管生长良好,判供试品符合规定。
《中华人民共和国药典》2010年版规定,对于固体制剂,当供试品装量( M)≥5 g,供试品最少检验量为10支,每支供试品接入每种培养液的最少量为500 mg,所以实验中每种培养液的供试品接入量为5 g。
采用直接接种法,样品(1 g)与培养液(20 mL)的比例为1:20,实验证明,与阳性对照组比较,加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液的实验组培养至第5天菌仍生长不明显,说明更昔洛韦眼用凝胶在该检验量和检验条件下对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑制作用,这可能与更昔洛韦眼用凝胶中含有抑菌剂苯扎溴铵有关。直接接种法最大的缺点是所有成分都在培养液中一起培养,供试品浓度高时会影响培养液的澄清度,无法观察结果;增加稀释度会造成供试品体积过大,为了保证接种量必须加大培养液用量,造成不必要的麻烦和浪费[3]。因此,直接接种法不适于更昔洛韦眼用凝胶的无菌检查,应选用薄膜过滤法。
阳性对照菌的选择:《中华人民共和国药典》2010年版规定,无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品,以金黄色葡萄球菌为对照菌[2]。因更昔洛韦眼用凝胶对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑制作用,所以更昔洛韦眼用凝胶的无菌检查阳性对照菌采用金黄色葡萄球菌。
《中华人民共和国药典》2010年版规定,只要供试品性状允许,无菌检查应采用薄膜过滤法。薄膜过滤法可增加检验量,有利于消除供试品的抑菌作用,比其他方法更加灵敏。更昔洛韦眼用凝胶含有卡波姆等成分,在溶液中形成乳胶状,不能通过孔径0.45 μm滤膜。实验证明,样品经过破乳作用,溶液呈现絮状后可迅速通过孔径0.45 μm滤膜。卡波姆系丙烯酸与丙烯液蔗糖交联的高分子聚合物,在很低的用量下(常规用量0.25%~0.5%)就能产生高效的增稠作用,从而制备出黏度范围大和不同流变性的乳液、软膏、乳膏、凝胶和透皮制剂。与聚丙烯酸相似,盐类电解质可使卡波姆凝胶的黏性下降[4]。硫酸镁是一种强电解质,在水中以离子状态存在,离子存在会降低卡波姆黏度,从而产生破乳现象,同时硫酸镁在微生物工业中常用作培养基成分,所以在供试液制备中加入5%硫酸镁溶液作为破乳剂。
在预实验中对加入5%硫酸镁溶液的量与加入顺序进行摸索。当加入量<10 mL时,5%硫酸镁溶液与样品5 g作用可以达到破乳目的,但继续加入0.1%蛋白胨溶液至100 mL后,溶液又迅速呈现乳胶状,仍不能通过孔径0.45 μm滤膜。此外应注意加入5%硫酸镁溶液与0.1%蛋白胨溶液的顺序。实验证明,取样品5 g,加入5%硫酸镁溶液10 mL,经振摇破乳后,溶液呈絮状,继续加入0.1%蛋白胨溶液至100 mL,溶液仍呈絮状,可以很容易通过滤膜。样品经薄膜滤过后无需用冲洗液冲洗滤膜,否则易造成滤膜堵塞。
需要说明的是,因供试品为凝胶制剂,含有卡波姆等成分,加入5%硫酸镁溶液经破乳后会出现絮状物质,经薄膜滤过,加入培养液后,各培养管均有少量絮状物质。至培养期结束除阳性对照管外,如各供试品管状况与培养前相比未发生变化,阳性对照管菌生长良好,可判供试品符合规定。
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