目的
探讨高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜4种温里药对家兔体外回肠平滑肌张力及细胞膜上Ca2+-ATPase活性的影响。
方法
利用BL-420E+生物信号采集处理系统,记录高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜水煎液对正常肠肌和氯化乙酰胆碱(ACh)、氯化钡(BaCl2)、磷酸组胺(His)所致体外肠肌收缩及对ACh诱导兔回肠平滑肌内钙释放和外钙收缩的影响,测量给药前1 min 内和给药后3 min 内的平均张力,并根据平均张力值计算抑制率。用定磷法测定高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜含药血清对肠平滑肌细胞膜上Ca2+-ATPase活性的影响。
结果
高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜高浓度组均能显著抑制正常情况下体外肠收缩(
结论
温里药可能通过减少细胞内钙释放,减少细胞外钙经由受体操纵性钙通道内流,同时抑制平滑肌Ca2+- ATPase活性,从而降低细胞内[Ca2+],舒张肠平滑肌。
Objective
To investigate the effects of four interior-warming drugs (galangal, cinnamon, evodia rutaecarpa, and dried ginger) on the tension of ileum smooth muscle and Ca2+-ATPase on the cell membrane in rabbits.
Methods
The effects of galangal, cinnamon, evodia rutaecarpa, and dried ginger were examined on normal ileum smooth muscle,
Results
Galangal, cinnamon, evodia rutaecarpa, and dried ginger at high concentrations could restrain
Conclusion
Interior-warming drugs may relax intestinal smooth muscle by reducing the intracellular calcium release and the extracellular calcium inflow via receptor-controlled calcium channels, and inhibiting the Ca2+-ATPase activity in smooth muscle.
Wistar大鼠15只,无特定病原体(SPF)级,雌雄兼用,体质量(200±20) g,合格证号:NO.44002100000606,生产许可证号:SCXK(粤)2011-0015;新西兰兔40只,清洁级,雌雄各半,体质量(2.0±0.2) kg,合格证号:NO.44002100003833,使用许可证号:SYXK(粤)2012-0125,以上动物由南方医科大学实验动物中心提供,饲养环境室温(22±2) ℃,相对湿度(60±5)%,喂颗粒标准饲料,自由饮水和摄食。
高良姜(产地:广东,康美药业股份有限公司,批号:140604351);肉桂(产地:广西,康美药业股份有限公司,批号:140809421);吴茱萸(产地:四川,康美药业股份有限公司,批号:140810871);干姜(产地:四川,玉林本草堂中药饮片有限公司,批号:140901);所有药材购自广东省中医院,并经过广东药学院中药学院李书渊教授鉴定为高良姜(
BL-420E+生物信号采集处理系统(成都泰盟科技有限公司);HW-400S型恒温平滑肌槽(成都泰盟科技有限公司);LD4-2A型台式离心机(北京医用离心机厂);JA2003型电子天平(上海恒平科学仪器有限公司,感量:0.01 g);UV765型紫外-可见分光光度计(上海精科仪器有限公司)。
1.4.1 药物对兔体外回肠自发收缩的影响
兔实验前禁食不禁水24 h,处死后,剖腹取近回盲部的回肠10 cm,立即放入含饱和混合气体(氧气占95%,二氧化碳占5%)的台氏液中,冲洗干净,分离肠系膜。用时取长1 cm的小段(
用生物信号采集处理系统软件提供的区间测量方法测量给药前1 min 内和给药后3 min内的平均张力,并根据平均张力值计算抑制率[5]:
1.4.2 药物对ACh、His、BaCl2所致兔体外回肠收缩的影响
前期处理同“1.4.1”项。生物信号采集系统先描记一段正常肠平滑肌自律曲线,待收缩稳定后分别向浴槽中加入ACh、His、BaCl2(终浓度分别为1×10-8,1.1×10-9,9.53×10-4 g·L-1),1 min后,分别加入各种药物,加药体积为100,300和900 μL,使形成不同终浓度,记录5 min后冲洗肠段。计算抑制率。
1.4.3 药物对ACh诱导兔体外回肠平滑肌两种收缩成分的影响
前期处理同“1.4.1”。生物信号采集系统先描记一段正常肠平滑肌自律曲线,待收缩稳定后,先加入ACh(终浓度为1×10-8 g·L-1),曲线上升稳定后继续加入氯化钙溶液(终浓度为1×10-6 g·L-1),使回肠进一步收缩并稳定,记录这两次曲线升高的高度的张力为对照。用无钙的台氏液冲洗3次并稳定30 min后加入各种药物,加药体积为100,300和900 μL,使形成不同终浓度,观察其对两种收缩成分所致张力的影响。
1.4.4 含药血清对肠平滑肌细胞膜上Ca2+-ATPase活性的影响
应用中药血清药理学方法[6-7]制备含药血清,选择Wistar大鼠15只,按照随机数字表法分为正常对照组、高良姜组(0.617 g·kg-1)、肉桂组(0.514 g·kg-1)、吴茱萸组(0.514 g·kg-1)、干姜组(1.028 g·kg-1),每组3只。正常对照组给予0.9%氯化钠溶液,实验药物组按临床成人每日最大药量进行体表面积比等效剂量换算大鼠药量。每天灌胃给药1次,连续7 d,末次给药后1 h 由腹主动脉采血,分离血清,经56 ℃水浴30 min 灭活处理后过滤除菌,混合相应各组3 只大鼠血清,置-20 ℃冻存备用。
将分离出的兔肠段置于含无菌0.9%氯化钠溶液的培养管中,持续通饱和混合气体,恒温,精确添加相应含药血清,使各给药组含药血清终浓度依次为50,100,200 μL ·mL-1,作用1 h,取出肠段,制备匀浆,用超微量ATP酶(Ca2+)测试盒和蛋白定量测试盒进行检测。
1.4.5 统计学方法
采用SPSS11.0版软件对所得数据进行统计分析,计量资料采用均数±标准差(
高良姜低、高浓度时均能显著抑制正常情况下体外肠的收缩(
高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜4种药物低、中、高浓度对ACh、His及BaCl2所引起的体外肠收缩均有显著抑制作用(
高良姜、肉桂、干姜对ACh诱导的内钙释放和外钙内流均有显著抑制作用(
2.4 4种药物含药血清对肠平滑肌细胞膜上Ca2+-ATPase活性的影响
正常对照组Ca2+-ATPease活性为(0.384±0.070) U·mg-1;高良姜5%,10%,20%含药血清组Ca2+-ATPease活性分别为(0.333±0.006),(0.325±0.041),(0.302±0.016) U·mg-1;肉桂5%,10%,20%含药血清Ca2+-ATPease活性分别为(0.325±0.008),(0.321±0.012),(0.307±0.016) U·mg-1;吴茱萸5%,10%,20%含药血清Ca2+-ATPease活性分别为(0.338±0.006),(0.332±0.036),(0.296±0.016) U·mg-1;干姜5%,10%,20%含药血清组Ca2+-ATPease活性分别为(0.331±0.009),(0.324±0.033),(0.313±0.003) U·mg-1。与正常对照组比较,高良姜、肉桂、干姜5%,10%,20%含药血清组和吴茱萸20%含药血清组肠平滑肌Ca2+-ATPase活性均降低(
笔者选取临床常见温里药高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜等,首先观察其水煎液对兔体外回肠平滑肌的作用。ACh与胃肠道壁层平滑肌上的M受体结合后通过G蛋白与腺苷酸环化酶耦联,使细胞内环磷酸腺苷(cAMP)浓度下降,导致细胞内Ca2+增加[8],平滑肌收缩。His则通过激活受体操纵性钙通道,Ca2+内流而致细胞内游离Ca2+浓度增高,从而引起胃肠平滑肌收缩。Ba2+可促使ACh的释放,从而兴奋胆碱能神经。生理活性物质ACh引起的肠平滑肌收缩既有内钙释放也有外钙内流,无钙台式液中加入ACh 引起肠的收缩为依内钙性收缩,系ACh促进细胞内钙释放所致,在ACh引起的依内钙性收缩的基础上加入Ca2+产生的收缩为依外钙性收缩,系ACh促进细胞外钙经由操纵性钙通道内流所致[9]。结果表明高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜水煎液除能舒张正常状态下的体外回肠,还能有效抑制ACh、His、BaCl2所致兔体外回肠收缩,对ACh 引起的依内钙性收缩和依外钙性收缩有很好抑制作用。
平滑肌细胞质游离Ca2+在平滑肌细胞收缩过程中起重要的“第二信使” 作用。平滑肌细胞舒张常伴随细胞质中游离Ca2+浓度([Ca2+]i)降至静息水平,细胞质游离Ca2+可被质膜钙泵(Ca2+-H+-ATPase)或平滑肌细胞膜上的Na+/Ca2+交换排出细胞外,也可通过肌质网膜钙泵摄取贮存于肌质网中[10]。胃肠道平滑肌肌浆网不发达,[Ca2+]i升高大部分来自细胞外Ca2+的经钙通道内流,目前已知Ca2+-ATPase具有5种不同亚型,各种亚型对Ca2+亲和力不同[11]。凡是能影响Ca2+-ATPase活性的物质也会影响平滑肌的收缩和舒张。在研究了高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜水煎液对家兔体外回肠平滑肌作用基础上,笔者进一步观察了药物对肠平滑肌细胞膜上Ca2+-ATPase活性的影响,为避免药物溶液的影响,采用含药血清进行实验。结果表明高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜含药血清均能抑制回肠平滑肌细胞膜上的Ca2+-ATPase 活性,此作用也许并不是药物发挥舒张回肠平滑肌作用的唯一途径,具体还需通过进一步实验深入探讨。
综上所述,高良姜、肉桂、吴茱萸、干姜的解痉止痛可能与抑制回肠平滑肌细胞膜上的Ca2+-ATPase 活性、拮抗Ca2+内流、舒张胃肠平滑肌有关。4味药中又以高良姜作用较为明显,推测其作用机制主要是抑制操纵性钙通道、抑制回肠平滑肌细胞膜上的Ca2+-ATPase 活性,减少细胞外钙经操纵性钙通道内流,抑制胆碱能神经而发挥解痉止痛的作用。
The authors have declared that no competing interests exist.