目的
探讨补脑胶囊对D-半乳糖联合β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导的阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆及抗氧化能力的影响,为其用于防治AD提供实验依据。
方法
雄性SD大鼠90只,随机分为模型对照组、吡拉西坦组、假手术组和补脑胶囊小、中、大剂量(0.79,1.58,3.15g·kg-1)组,每组15只。采用腹腔注射D-半乳糖联合双侧脑室注射Aβ25-35制备AD模型,连续灌胃给予相应药物治疗8周。采用Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力变化;苏木精-伊红(HE)染色观察脑细胞形态学变化;分光光度法测定脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。
结果
补脑胶囊中、大剂量组大鼠目标象限滞留时间[分别为(20.39±7.75),(20.82±5.09)s]较模型对照组[(12.35±6.95)s]明显增加(P<0.01);补脑胶囊中、大剂量组大鼠脑神经细胞的形态较模型对照组明显改善,且接近假手术组;脑组织酶活性显著增强(P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.01)。
结论
补脑胶囊能剂量依赖性地改善AD模型大鼠的学习记忆能力,其作用机制可能与增强脑组织抗氧化酶的活性和增强清除氧化产物有关。
Objective
To investigate the effect of Bunao capsule on learning, memory and antioxidative abilities of rats with Alzhheimer’s disease (AD) induced by D-galactose combined with amyloid β-protein (Aβ25-35), and provide experimental basis for the prevention and treatemtn of AD.
Methods
A total of 90 SD male rats were randomly divided into model control group, piracetam group, sham operated group,Bunao capsule (0.79, 1.58, 3.15 g·kg-1) groups (n=15 each).The rat models were established by intraperitoneal injection of D-galactose and injection of Aβ25-35 into the bilateral lateral cerebral ventricle.Then rats were given corresponding drugs by gavage in different groups for 8 weeks.The learning and memory abilities were meseured by Morris water maze test.The morphology of brain cells was observed by HE staining.The activities of glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD), and the malondialdehyde (MDA) contents in the brain tissues were measured by spectrophotometry.
Results
The target quadrant residence time was (20.39±7.75)s and (20.82±5.09)s in Bunao capsule (1.58, 3.15 g·kg-1) groups, which were significantly increased as compared with that in model control group [(12.35±6.95) s](P<0.01).Brain nerve cell morphology in Bunao capsule (1.58, 3.15 g·kg-1) groups was obviously improved as compared with that in model control group, and was close to that in sham operated group.The activities of GSH-Px and SOD were significantly increased, and MDA contents decreased in Bunao capsule groups as compared with those in model control group (P<0.01).
Conclusion
Bunao capsule can dose-dependently improve the learning, memory and antioxidative abilities of AD rats.The mechanism may involve upregulation of antioxidative enzyme activities and removal of oxidative products.
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种多发生在老年期的、多病因的大脑皮质系统性病变[1]。随着世界人口老龄化,预计到2020年全球痴呆患者将升至4 000万例,其中AD在痴呆中所占比例最高。目前治疗AD的治疗药物主要有胆碱酯酶抑制药、神经细胞生长因子增强药等。这些药物主要是扩张脑血管及改善代谢,疗效并不让人满意。AD尚缺乏理想的治疗药物和根治方法,因此寻找新的药物成为广大研究者关注的热点[2]。补脑胶囊由人参、石菖蒲、远志等中药配伍而成。β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)在脑内海马区的聚集能引起机体自由基的过氧化反应,进而引起神经细胞损伤和死亡,提高相关氧化酶的活性能降低发生AD的风险[9]。笔者从提高机体抗氧化酶的活性和清除氧化产物丙二醛(MDA)角度出发,为探索AD新的防治途径提供依据。
健康清洁级雄性SD大鼠,购于贵阳医学院实验动物中心,体质量(350±20) g,生产许可证号:SCXK(黔)2012-0001,使用许可证号:SYXK(黔)2012-0001。在室温(22±2) ℃适应性喂养1周,相对湿度50%~75%,自由进食饮水,自然昼夜节律光照。
D-半乳糖(Solario 公司,批号:1337);Aβ25-35(Sigma公司,批号:112M4775V);注射用青霉素钠(华北制药公司,批号:20131220);补脑胶囊(贵阳中医学院附属第二医院制剂室提供,批号:20140505);吡拉西坦(湖北人福药业公司,批号:13131231);谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)与超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒(上海沪鼎生物公司,批号:201408)。
大鼠脑立体定位仪(泰盟NARISHIGE SN-2型);台式冷冻离心机(Eppendorf Germany,5810-R型);紫外-可见分光光度计(岛津公司,UV-2401型);微量进样器(10 μL,上海安亭微量进样器厂)。
SD大鼠随机分为模型对照组、吡拉西坦组、假手术组和补脑胶囊小、中、大剂量组,每组15只。除假手术组外,每只大鼠腹腔注射D-半乳糖80 mg·kg-1·d-1,连续6周,假手术组注射等体积0.9%氯化钠溶液。第7周除假手术组外各组大鼠双侧脑室注射Aβ25-35,假手术组注射等体积0.9%氯化钠溶液。手术后第2周起开始,补脑胶囊组按小、中、大剂量(0.79,1.58,3.15 g·kg-1,将内容物配制成相应溶液)灌胃治疗,吡拉西坦组(0.43 g·kg-1)也同时进行灌胃治疗,模型对照组和假手术组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃,持续8周[3]。Aβ25-35的孵育:用无菌0.9%氯化钠溶液将Aβ25-35稀释成2 μg· μL-1,-20 ℃保存,使用前在37 ℃恒温箱孵育4 d,使其变为聚集态。使用过程中置于4 ℃冰箱保存。Aβ25-35的注射方法:大鼠手术前12 h禁食不禁水。经8%水合氯醛溶液腹腔麻醉(4 mL·kg-1),固定于脑立体定位仪上,颅顶部正中经10%过氧化氢溶液消毒后切开皮肤,在前囟后3.0 mm,左右旁开2.0 mm的位置,用牙科钻在颅骨钻一小孔,垂直进针2.8 mm,注射聚集态Aβ25-35溶液5 μL,注射时间5 min,留针3 min后缓慢撤针,用骨蜡填补小洞并缝合伤口。假手术组大鼠同一位置注射等剂量无菌0.9%氯化钠溶液作为对照。手术后每只大鼠腹腔注射青霉素钠(20 U·d-1),连续 3 d[4-5]。
采用Morris水迷宫实验判断大鼠学习记忆能力,实验方法参照文献[6]。动物预先训练2 d,每天3次,每次间隔2 h,之后开始以下实验,①定位航行实验(place navigation):该实验连续4 d。设定最长游泳时间为120 s,记录大鼠找到平台所需要的时间和游泳距离,分别记作逃离潜伏期和探索距离,作为检测大鼠的学习能力指标。②空间探索实验(spatial probe):于定位航行结束的次日撤除平台,从原平台象限的对侧象限入水,记录60 s内的游泳轨迹,观察大鼠在原平台象限停留时间,作为检测大鼠记忆能力指标。数据搜集和整理由BI2000图像分析系统完成。
用水合氯醛麻醉大鼠后,快速处死,取出脑组织,一半脑组织切成厚约3 mm的组织块,4%多聚甲醛溶液固定24 h。一次脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片,HE染色,在光镜下观察切片并记录结果。另一半脑组织用滤纸拭去血渍,称质量,用4 ℃、无菌0.9%氯化钠溶液制成10%组织匀浆液,3 000 r·min-1离心(r=13.5 cm)10 min,取上清液,测定各氧化指标。SOD的测定采用黄嘌呤氧化酶法;MDA的测定采用硫代巴比妥酸比色法;GSH-Px的测定采用紫外-分光光度计比色法;所有操作严格按照试剂盒说明书进行。
本实验数据用SPSS13.0版软件进行统计分析。数据结果以均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
Morris水迷宫实验结果提示,模型对照组大鼠逃避潜伏期较假手术组均明显延长(t=2.578,P<0.01)。补脑胶囊各组随剂量增加,逃离潜伏期较模型对照组均明显缩短(P<0.05)。实验第5天去掉平台,观察各组大鼠的空间探索能力。结果显示,模型对照组大鼠与假手术组比较,在目标象限内滞留时间显著缩短(t=4.620,P<0.01);与模型对照组比较,补脑胶囊各组随着剂量增加,在目标象限的滞留时间增加(P<0.05),见
光镜下,苏木精染色细胞核呈蓝色,伊红染色细胞质呈粉红色。假手术组在光镜下未见有明显病理改变,神经细胞结构排列整齐,细胞间层次清晰,细胞形态正常,无明显水肿,极少见凋亡征象;模型对照组神经细胞结构排列紊乱,细胞质水肿,细胞核深染、固缩,镜下能看见凋亡细胞;补脑胶囊大、中、小剂量组神经细胞形态和排列均较模型对照组有明显改善,且大、中剂量组跟假手术组的形态和排列相似,见
海马和大脑皮质出现高密度的老年斑和神经纤维缠结是AD主要病理学特征[2]。研究证实,Aβ是老年斑的主要神经毒性成分,AD患者脑内过多Aβ的神经毒性与其聚集状态和构象状态密切相关,与β折叠结构程度有关,高β折叠含量导致Aβ的纤丝聚合,使得Aβ由可溶性变成不可溶性,产生神经毒性[3-5]。因此Aβ25-35常用来建立AD的动物模型,用以研究和评价治疗AD的药物。笔者采用Aβ25-35在37 ℃温箱中孵育4 d,使其变成聚集态Aβ,以增强其神经毒性[6]。由Morris水迷宫数据可知,模型对照组与假手术组大鼠比较,逃离潜伏期显著增加,在目标象限内滞留时间显著缩短,较好地反映了AD的外在表现。氧化应激在AD整个病理过程中起着重要的作用[7-8]。AD属于中医学“呆病”“健忘”范畴,为本虚标实之证。补脑胶囊的君药是人参,所含的人参皂苷组分可有效地提高红细胞数量和SOD活性,增强机体抗氧化能力[9-10];方中远志、石菖蒲皆有醒神开窍之效,是补脑健智的良药。实验选取的阳性药物吡拉西坦能增强神经细胞兴奋的传导,提高机体抗氧化水平,增强AD患者的记忆和学习能力。经补脑胶囊的干预治疗后,AD模型大鼠能明显改善先前症状,且呈剂量依赖性关系,说明补脑胶囊能改善AD模型大鼠的学习记忆能力;MDA是脂质过氧化的产物,其含量可反映氧化应激对机体的损害程度;SOD和GSH-Px活性可反映机体清除超氧阴离子自由基能力。实验结果提示:小、中、大剂量补脑胶囊对AD模型大鼠抗氧化能力均有不同程度改善,能有效清除体内代谢产物MDA,显著增强SOD、GSH-Px的活性,从而起到保护脑组织的作用。
综上所述,本研究结果表明,补脑胶囊能清除AD模型大鼠体内自由基,起到抗氧化、改善学习记忆能力的作用,提示补脑胶囊对于AD等神经退行性疾病具有良好的治疗应用前景。但AD的发病机制是多元性的,补脑胶囊提高机体学习记忆能力和抗氧化的具体作用机制还有待进一步研究。
The authors have declared that no competing interests exist.