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医药导报
医药导报, 2016, 35(5): 461-465
急性淋巴细胞白血病患儿ATIC和GSTP1基因多态性与甲氨蝶呤血浆浓度及不良反应的关系*
DOI 10.3870/j.issn.1004-0781.2016.05.007
郑恒1, 丁水平1, 魏盈盈1, 张柳青2, 胡群2, 刘爱国2, 刘双又2
华中科技大学同济医学院附属同济医院1.药学部
2.儿科,武汉 430030
Association of ATIC, GSTP1Genetic Polymorphisms with HD-MTX Plasma Concentration, Adverse Reactions in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia

作者简介 郑恒(1969-),男,广东中山人,主任药师,博士,研究方向:临床药理学。电话:027-83662498,E-mail:hzheng@tjh.tjmu.edu.cn。

通信作者 张柳青(1962-),女,湖南新邵人,副教授,副主任医师,学士,研究方向:儿童血液肿瘤。电话:(0)13971012655,E-mail:lqz20122@163.com。
基金资助: 基金项目 国家科技部重大新药创制专项(2012ZX09303018)
中图分类号: R979.1     文献标识码: A     文章编号: 1004-0781(2016)05-0461-05
摘要:

目的

探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿氨基咪唑氨甲酰转移酶(ATIC)、谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)基因多态性与使用大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)化学治疗(化疗)期间的血浆浓度及不良反应的关系。

方法

ALL患儿70例,收集外周血,提取DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术和直接测序的方法分析ATIC、GSTP1基因的基因型;采用酶放大免疫法(EMIT)测定MTX给药后48 h的血药浓度;收集患儿HD-MTX化疗期间的临床资料,统计不良反应相关信息。

结果

ATIC T26293C和 GSTP1 A313G位点都存在多态性。ATIC T26293C位点患儿TT、CT和CC基因型的分布频率分别为4.35%,39.13%,56.52%;T和C等位基因的分布频率分别为23.91%和76.09% 。GSTP1 A313G位点患儿AA、GA和GG基因型的分布频率分别为68.57%,28.57%,2.86%;A和G等位基因的分布频率分别为82.86%和17.14% 。不同基因型患儿间48 h MTX血药浓度/剂量比值均差异无统计学意义(均P>0.05) 。GSTP1 A313G位点各基因型胃肠道反应发生率由低到高依次为AA、GA、GG,基因多态性与胃肠道反应差异有统计学意义(P<0.05);GSTP1 A313G位点各基因型骨髓抑制发生率由低到高依次为GG、AA、GA,基因多态性与骨髓抑制之间差异有统计学意义(P<0.05)。

结论

GSTP1 A313G位点的多态性与ALL患儿HD-MTX化疗后的胃肠道反应和骨髓抑制显著相关。
关键词: 甲氨蝶呤 ; 淋巴细胞白血病 ; 急性 ; 氨基咪唑氨甲酰转移酶 ; 谷胱甘肽-转移酶P1 ; 基因多态性 ; 血浆浓度 ; 不良反应

Abstract:

Objective

To investigate the association of genetic polymorphisms of ATIC and GSTP1 with plasma concentrations and adverse reactions of high-dose methotrexate (HD-MTX) in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL).

Methods

A total of 70 peripheral blood samples were obtained from ALL children for extraction of genome DNA.The gene polymorphisms of ATIC T26293C and GSTP1 A313G locus were examined by using PCR and direct sequencing.Enzyme multiplied immunoassay technique (EMIT) was employed to determine the plasma concentration of MTX in 48 h.Clinical data of patients were collected during HD-MTX chemotherapy, and the adverse reactions were statistically analyzed.The associations of ATIC and GSTP1 genotypes with MTX plasma concentration and adverse reactions were investigated.

Results

There were genetic polymorphisms at the SNP of ATIC T26293C and GSTP1 A313G.At the SNP of ATIC T26293C, the percentages of TT, CT and CC genotypes in ALL children were 4.35%, 39.13% and 56.52%, respectively, and the frequencies of T and C alleles were 23.91% and 76.09%.At the SNP of GSTP1 A313G, the percentages of AA, GA and GG genotype were 68.57%, 28.57% and 2.86%, respectively, in ALL children.The frequencies of A and G alleles were 82.86% and 17.14%, respectively.No statistically significant difference was found in the ratio of blood MTX concentration to MTX dose at 48 h between children with different genotypes (P>0.05).In the GSTP1 A313G site, genotypes that induced the gastrointestinal reactions in the order from low to high were AA, GA, GG, and there was a significant association between gene polymorphism and gastrointestinal side effects (P<0.05).In the GSTP1 A313G site, genotypes that induced myelosuppression in the order of low to high were GG, AA, GA, and a significant association was noted between gene polymorphism and myelosuppression (P<0.05).

Conclusion

There are significant associations between GSTP1 A313G polymorphism and gastrointestinal side effects or myelosuppression after HD-MTX chemotherapy in ALL children.
Key words: Methotrexate ; Lymphoblastic leukemia ; acute ; Aminoimidazole carboxamide ribonucleotide transformylase ; Glutathione -transferase P1 ; Genetic polymorphism ; Plasma concentration ; Adverse reactions

中图分类号 R979.1;R733.71 文献标识码 A 文章编号 1004-0781(2016)05-0461-05

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病,是儿童恶性肿瘤中最常见的类型。甲氨蝶呤(methotraxate,MTX)是儿童ALL最重要治疗药物之一。大剂量甲氨蝶呤(high-dose methotrexate,HD-MTX)在ALL的维持治疗和髓外白血病的防治中发挥着极其重要的作用[1]。但MTX选择性差,在杀灭肿瘤细胞的同时,不可避免地干扰正常细胞的代谢。因而临床表现出不同程度的不良反应,如胃肠道反应、骨髓抑制、肝脏损伤等[2]。遗传因素可能是影响个体对MTX代谢和不良反应差异的主要原因之一。研究表明腺苷途径中氨基咪唑氨甲酰转移酶(aminoimidazole carboxamide ribonucleotide transformylase,ATIC)基因多态性可能作为类风湿关节炎患儿使用MTX出现不良反应的预测指标[3]。谷胱甘肽S-转移酶P1(glutathione S-transferase P1,GSTP1)基因编码产物GSTP1酶在体内发挥解毒、抗氧化等作用[4]。笔者以ALL患儿为研究对象,探讨ATIC基因T26293C位点、 GSTP1 基因A313G位点多态性与HD-MTX血药浓度及不良反应的关系。

1 资料与方法
1.1 临床资料

2011 年5月—2014年12月我院住院ALL患儿70例,男47例,女23例,男:女为1:0.49,年龄2.5~15.0岁,平均(6.50±2.74)岁。每例患儿均用形态学、免疫学及细胞遗传学诊断分型(依据小儿急性白血病诊断建议[5])其中,B系60例,T系10例。纳入标准:依据形态学(FAB分型)、免疫学、细胞遗传学和分子生物学诊断标准诊断为ALL,至少完成了1个疗程的HD-MTX化学治疗(化疗)。排除标准:使用过程中出现严重变态反应或无法耐受化疗,未完成1个疗程的HD-MTX化疗自行出院或死亡的患儿。

1.2 药品、试剂与仪器

MTX注射液,规格:每支 1 g(辉瑞制药有限公司,批号:FK99A);MTX检测试剂盒

[西门子医学诊断产品(上海)有限公司,批号:6L119UL];干粉治疗药物检测控制品(上海伯乐公司,批号:57320);西门子Viva-E全自动药物浓度分析系统[西门子医学诊断产品(上海)有限公司]。

1.3 治疗方法

化疗方案依据《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议(第3次修订草案)》实施。标危组给予MTX2.0~3.0 g·(m2)-1,高危组给予MTX 3.1~5.0 g·(m2)-1。给药时,先用MTX总量的1/6(每次不超过500 mg)作为突击量在30 min内快速静脉滴入,其余在23.5 h内滴完,注意水化、碱化,监测尿pH值、肝肾功能。突击量MTX滴入后0.5~2.0 h内,行三联鞘内注射(MTX12.5 mg、阿糖胞苷35 mg、地塞米松5 mg)1次。开始滴入MTX36 h后用甲酰四氢叶酸钙(calcium folinate,CF)解救,q6h首剂静脉注射[一般剂量15 mg·(m2)-1],如监测中发生排泄延迟(48 h MTX血浆浓度>1.16 μmol·L-1或者72 h MTX血浆浓度>0.22 μmol·L-1),则追加CF解救次数和剂量,并继续监测MTX血浆浓度。

1.4 血浆MTX浓度测定

在ALL患儿给予大剂量MTX治疗后48 h采静脉血1 mL,离心取上清液,采用酶放大免疫分析法测定血药浓度。

1.5 不良反应的观察

观察每一个化疗周期中患儿恶心、呕吐、腹泻、出血、黏膜损伤情况,记录血常规、尿常规、肝肾功能等检查结果,按照美国国立癌症研究所的常规毒性判定标准4.0版(NCI-CTC4.0)评价ALL患儿HD-MTX化疗过程中所出现的不良反应并记录。

1.6 基因型检测

采集患儿外周静脉血2~3 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中低温(4 ℃)保存,全血 3 000 r·min-1离心(r=13 cm)5 min,弃上层血浆,在1周内用改良碘化钾法提取脱氧核糖核酸(DNA)。采用聚合酶链反应(PCR)产物直接测序的方法检测ATIC T26293C和GSTP1 A313G位点基因多态性。用Premier 5.0版软件进行引物设计,ATIC T26293C位点上游引物序列为5'-TTTTGGAGGGCAGAGAGGAG-3',下游引物5'-AACC-CTCACACCCATCTCAG-3'。GSTP1 A313G位点引物设计,序列为上游引物5'-ATCCCCAGTGACTGAC-TGTGTGTTGA-3',下游引物5'-GGTTACTTGGCT-GGTTGATGTC-3'。PCR反应条件如下:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环,72 ℃延伸7 min,4 ℃贮存。PCR完成后作1.0 g·L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。以上游和下游引物为测序引物,对PCR产物进行直接测序。

1.7 统计学方法

采用SPSS17.0版软件对数据进行统计学处理。计算各组基因型及等位基因频率,用χ2检验确认各组基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡,考察ATIC、GSTP1基因多态性分布是否来源于遗传平衡群体。计量资料用均数±标准差(±s)表示,数据先进行正态性和方差齐性检验,若满足则用单因素方差分析,若数据转化后仍不满足正态性,则使用秩和检验分析不同基因型之间血药浓度差别是否有统计学意义;χ2检验分析不同基因型之间不良反应的差异;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 基因型与等位基因分布情况

70例ALL患儿均接受GSTP1和ATIC基因型检测,ATIC基因型检测有1例未得到结果。对ATIC基因SNP位点T26293C和GSTP1基因SNP位点 A313G基因型分布进行Hardy-Weinberg分析,结果均显示 P>0.05,各基因型频率达到遗传平衡,研究资料具有群体代表性。SNP位点等位基因、基因型分布情况见表 1。

表1 ALL患儿ATIC T26293C和GSTP1 A313G基因位点的等位基因、基因型频率的分布
Tab.1 Frequency distribution of the allele and genotype of ATIC T26293C and GSTP1 A313G in children with ALL
基因位点 基因/等位
基因		 数量/
个		 百分比/
%
ATICT 26293C TT 3 4.35
CT 27 39.13
CC 39 56.52
T 33 23.91
C 105 76.09
GSTP1 A313G AA 48 68.57
GA 20 28.57
GG 2 2.86
A 116 82.86
G 24 17.14

表1 ALL患儿ATIC T26293C和GSTP1 A313G基因位点的等位基因、基因型频率的分布

Tab.1 Frequency distribution of the allele and genotype of ATIC T26293C and GSTP1 A313G in children with ALL

2.2 ATIC、GSTP1基因型与HD-MTX化疗后MTX浓度的关系

共收集298例次接受HD-MTX治疗患儿48 h 血药浓度,剔除4例共294例次。对于ATIC基因,其中1例患儿基因型缺失,故纳入统计的血药浓度共290例次。 ATIC各基因型患儿甲氨蝶呤48 h C/D值为TT型(0.32±0.62) μmol·L-1、CC型(0.39±1.32) μmol·L-1、CT型(0.41±1.00) μmol·L-1,纯合子和杂合子突变型均高于野生型,但不同基因型患儿间48 h MTX血浆浓度/剂量的对数值差异无统计学意义(P>0.05) ;GSTP1各基因型患儿甲氨蝶呤48 h C/D值AA型为(0.39±1.21) μmol·L-1、GA型为(0.39±1.18) μmol·L-1、GG型为(0.46±0.65) μmol·L-1,不同基因型患儿间48 h MTX血药浓度/剂量的对数值差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 ALL患儿基因型与48 hMTX血药浓度/剂量比值的关系
Tab.2 Relationship of the genotype of pediatric patients with ALL and the ratio of 48 h plasma concentration of MTX to its dose
基因位点与
基因型		 例次 48 h血清MTX浓度/剂量
(μmol·m2·L-1·g-1)		 lg MTX
浓度/剂量		 P值
ATICT26293C
TT 16 0.32±0.62 -0.77±0.42
CT 160 0.41±1.10 -0.78±0.44
CC 114 0.39±1.32 -0.77±0.43 0.367
GSTP1A313G
AA 200 0.39±1.21 -0.77±0.44
GA 90 0.39±1.18 -0.82±0.40
GG 4 0.46±0.65 -0.62±0.52 0.203

表2 ALL患儿基因型与48 hMTX血药浓度/剂量比值的关系

Tab.2 Relationship of the genotype of pediatric patients with ALL and the ratio of 48 h plasma concentration of MTX to its dose

2.3 基因多态性与不良反应的关系

HD-MTX治疗淋巴细胞白血病常见的不良反应有胃肠道反应、肝脏损伤和骨髓抑制,共收集不良反应记录295次。对于ATIC基因其中1例患儿基因型缺失,纳入统计的不良反应共291例次。ATIC T26293C不同基因型的胃肠道反应发生率之间差异无统计学意义(P>0.05),GSTP1 A313G不同基因型的胃肠道反应发生率之间差异有统计学意义(χ2=8.337,P<0.05),AA、GA、GG基因型患儿胃肠道反应发生率依次增高;ATIC T26293C、GSTP1 A313G基因不同基因型的肝脏损伤发生率之间均差异无统计学意义(P>0.05);给药后骨髓抑制的发生率最高,ATIC T26293C位点TT、CT、CC基因型骨髓抑制发生率依次增高,但未发现ATIC T26293C不同基因型的骨髓抑制发生率之间差异有统计学意义,GSTP1 A313G不同基因型的骨髓抑制发生率之间差异有统计学意义(χ2=7.171,P<0.05),见表3。

表3 ALL患儿基因型与不良反应的关系
Tab.3 Relationship of the genotype of pediatric patients with ALL and adverse reaction
基因位点 基因型 例次 胃肠道反应 肝脏损伤 骨髓抑制
例 % P 例 % P 例 % P
ATICT26293C TT 16 1 6.25 4 25.00 13 81.25
CT 108 28 25.93 19 17.59 92 85.19
CC 167 43 25.75 0.211 36 21.56 0.647 144 86.23 0.855
GSTP1A313G AA 203 50 24.63 42 20.69 174 85.71
GA 88 32 36.36 16 18.18 81 92.05
GG 4 3 75.00 0.015 1 25.00 0.859 2 50.00 0.028

表3 ALL患儿基因型与不良反应的关系

Tab.3 Relationship of the genotype of pediatric patients with ALL and adverse reaction

3 讨论

HD-MTX为ALL最常用的巩固期治疗方案之一。MTX选择性差,在杀灭肿瘤细胞的同时,不可避免地干扰正常细胞的代谢,不同患儿使用相同剂量的MTX时,血药浓度可能不同,出现的不良反应不同,毒副作用程度也不同。基因位点多态性被认为是个体血药浓度、不良反应差异的重要因素之一。

ATIC是腺苷代谢途径的关键酶之一,与叶酸代谢紧密相关。申世华等[3]研究发现ATIC基因多态性与MTX不良反应有关,主要表现为服药后恶心、呕吐、胃肠道不良反应等;DERVIEUX等[6]发现,ATIC的变异会增加MTX引起胃肠道和中枢神经系统不良反应的风险。在本研究中,分析ATIC各基因型与HD-MTX给药后血药浓度和不良反应的关系时,ATIC T26293C位点血药浓度/剂量均值由低到高依次为TT、CC、CT;不同基因型的各不良反应发生率也存在差异,但并没有发现ATIC不同基因型的血清MTX浓度及不良反应差异有统计学意义。推测可能是该位点对于酶活性的影响较小,有待进一步研究证实。

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)属Ⅱ相代谢酶,GSTP1是GST家族的重要成员,基因第303位点碱基发生A→G突变后,其105密码子异亮氨酸被缬氨酸取代,可引起GSTP1酶活性下降[7]。GSTP1在肝脏组织中有较高表达,GSTP1通过与致突变亲电子物质结合而发挥解毒作用[8]。酶活性减弱或丧失,就可能使药物或代谢产物在体内积蓄,疗效增加,同时药物不良反应也相应增加。在本研究中GSTP1 A313G位点携带GG型患儿血药浓度/剂量比值高于AA和GA型患者,但GSTP1 A313G位点不同基因型ALL患儿的48 h血药浓度之间差异无统计学意义(P>0.05)。任艳飞等[9]研究发现ALL高危组患儿GSTP1 A313G位点突变型与野生型胃肠道反应差异有统计学意义,还发现相似结果在ALL患儿中AA、GA、GG型患儿胃肠道反应发生率依次增加,GSTP1 A313G位点不同基因型患儿的胃肠道反应发生率之间差异有统计学意义(P<0.05);骨髓抑制发生率由低到高依次为GG、AA、GA,GSTP1 A313G位点不同基因型患儿的骨髓抑制发生率之间差异有统计学意义(P<0.05)。任艳飞等[9]研究发现突变型对患儿骨髓抑制表现之一的外周血红蛋白减少有保护作用,与本研究结果不一致。GSTP1 A313G位点不同基因型患儿的肝脏损伤发生率之间差异无统计学意义(P>0.05),在HORINOUCHI等[10]和任艳飞等[9]的研究中也未发该位点基因多态性与肝毒性有显著相关性。

综上所述,本研究表明GSTP1 A313G基因多态性与ALL患儿HD-MTX化疗后的胃肠道不良反应和骨髓抑制存在一定的相关性。但还需综合其他MTX代谢相关位点基因多态性并扩大研究的样本量来进一步深入研究,从而为预测MTX的毒性、调整临床用药、实现个体化治疗提供更多依据。

The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
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[本文引用:1]
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