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第七届湖北十大名刊提名奖
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, 季可非, JI Kefei
目的
制备关节腔注射用醋酸曲安奈德(TAA)温敏凝胶,并考察其体外释放度。
方法
以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA) -聚乙二醇(PEG)-PLGA为凝胶基质,以黄原胶为助悬剂、氯化钠(NaCl)为絮凝剂,制备TAA混悬温敏凝胶,通过其含量测定方法的建立和体外释放度考察,对制剂进行初步评价。
结果
最佳处方:凝胶基质PLGA-PEG-PLGA含量25%,助悬剂黄原胶含量0.05%,絮凝剂NaCl含量0.9%,主药TAA含量4 mg·mL-1,胶凝温度为35.3 ℃,平均回收率(98.98±0.31)%。采用无膜释放方法,16 d内体外累积释药达83.31%,药物释放遵循Ritger-Peppas数学模型。
结论
TAA温敏凝胶具有温敏特性和明显的缓释作用,有望成为新的关节腔给药传递系统。
Objective
To prepare triamcinolone acetonide acetate (TAA) thermosensitive hydrogel for intra-articular injection, and to investigate its release
Methods
TAA suspending thermosensitive hydrogel was prepared by using poly lactic-co-glycolic acid (PLGA)-polyethylene glycol (PEG)-PLGA as gel matrices, xanthan gum as suspending agent and NaCl as flocculant.It was evaluated preliminarily by determining its contents and its
Results
The best compositions for preparation of TAA suspending thermosensitive hydrogel were 25% PLGA-PEG-PLGA, 0.05% xanthan gum, 0.9% NaCl and 4 mg·mL-1 TAA.The gelation temperature was 35.3 ℃.The average recovery was (98.98±0.31)%. By the method of membraneless dissolution, the accumulative drug release was up to 83.31% at 16 days.The drug release followed Ritger-Peppas methematical model.
Conclusion
The TAA thermosensitive hydrogel with obviously sustained release is expected to become a new drug delivery system for intra-articular injection.
醋酸曲安奈德(triamcinolone acetonide acetate,TAA)为中长效糖皮质激素,能明显抑制类风湿关节炎患者关节滑膜组织分泌的白细胞介素-1和肿瘤坏死因子,从而减少毛细血管以及纤维母细胞的增生,其抗炎作用强且起效快,能够显著改善病情。目前市售用于关节腔注射的曲安奈德制剂是以混悬剂的形式,给药后迅速渗透到体循环,药物在关节腔内存留时间短、药效持续时间短,以至给药频繁且剂量难以控制,最终导致药物不良反应增多,从而限制了其临床应用[1]。
温敏凝胶属于凝胶剂中一种智能、新型的载药系统[2]。在环境或贮存温度以下时,温敏凝胶呈可自由流动的液体,注射进入体内后可在注射部位发生相转变形成半固体状态凝胶。此时,温敏凝胶可较长时间与作用部位紧密粘附,从而延长药物在给药部位的滞留时间,提高药物的生物利用度,达到了局部给药和药物缓释的作用效果。笔者制备关节腔注射用TAA温敏凝胶,并对其进行体外评价,以期弥补现有市售制剂在治疗中的不足,为临床应用提供参考。
Agilent1220高效液相色谱一体化系统(美国Agilent公司),Welchrom C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),AB204-N电子天平(感量:0.1 mg,梅特勒-托利多仪器有限公司),85-2数显恒温磁力搅拌器(常州丹瑞实验仪器设备有限公司),SHZ-82恒温震荡器(国华企业集团有限公司),UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。
TAA(湖北昊博化工有限公司,含量:99%,批号:20140802),TAA标准品(中国食品药品检定研究院,批号:100125-201105,含量97.8%),聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)75/25-聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)1000-PLGA75/25(相对分子质量5 378,济南岱罡生物工程有限公司),氯化钠(NaCl,国药集团化学试剂有限公司,含量>99.5%,批号:20140218),0.9%氯化钠注射液(安徽双鹤药业有限责任公司,批号:140821),黄原胶(上海立奇化工助剂有限公司,含量99.8%),十二烷基硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司,含量≥86%,批号:20140619)。
精密称量所需比例对应的适量PLGA-PEG-PLGA聚合物,置于干燥洁净的烧杯中,放入搅拌子和适量纯化水,在恒温磁力搅拌器上以恒定转速搅拌,直至聚合物均匀分散其中。在4 ℃冰箱中静置,整个过程需要5~6 d,直至得到无色或淡蓝色透明可自由流动的溶液。继而在其中加入适量的助悬剂黄原胶、絮凝剂NaCl[3],搅拌使之分散均匀。而后将一定量过孔径74 μm筛的TAA缓慢加入其中,搅拌均匀,经60Co照射的γ射线辐射灭菌后即得TAA混悬温敏凝胶。
2.2.1 正交设计实验
通过单因素考察实验,凝胶基质选择略低于人体体温且高于室温的胶凝温度范围(33~37 ℃)时所对应的PLGA-PEG-PLGA的含量,即18%~25%;因助悬剂黄原胶可增加样品的黏性,综合其助悬效果、再分散性和流动性,选取0.05%~0.20%为宜;考虑再分散性和渗透压问题,絮凝剂NaCl含量范围选择0.0%~0.9%。
基于此,确定主药TAA含量为4 mg·mL-1,以胶凝温度为考察指标,以PLGA-PEG-PLGA(A)、黄原胶(B)、NaCl(C)的含量为影响因素,进行三因素三水平正交实验。正交设计的实验因素及水平见
表1 TAA温敏凝胶正交设计的实验因素及水平
Tab.1 Factors and levels of orthogonal design on TAA thermosensitive hydrogel %
表2 正交实验设计与胶凝温度数据结果
Tab.2 Orthogonal experiment design and results of gelation temperature data
表3 不同处方胶凝温度数据的方差及显著性分析
Tab.3 Analysis on variance and significant of temperature data of hydrogel with different prescription
通过正交实验,选择胶凝温度最接近35 ℃的实验号为4,7,8的3种处方为较优处方,然后进一步优化。
2.2.2 通针性实验
按照选取的较优处方制备温敏凝胶进行不同温度下的通针性实验,结果见
2.2.3 沉降体积比实验
将适量按照较优处方配制的温敏凝胶分别装入具塞试管中,密塞,用力振摇,记下混悬凝胶的起始液面高度(
表4 3种较优处方在不同温度下的通针性
Tab.4 Syringeability of three kinds of optimized prescriptions under different temperature
2.2.4 再分散性实验
将按照较优处方配制的TAA温敏凝胶静置一段时间,记录在磁力搅拌器上以60 r·min-1转速使沉降药物再分散所需要的转动子数目。结果见
表5 较优处方的分散性比较
Tab.5 Dispersion of the optimized prescriptions
2.2.5 最优处方的确定与检验
经过处方筛选与优化,确定最优处方为实验号7的处方,即温敏凝胶基质PLGA-PEG-PLGA含量为25%,助悬剂黄原胶含量为0.05%,絮凝剂NaCl含量为0.9%,主药TAA含量为4 mg·mL-1。按照“2.1”项标准制备,并对其进行检验,结果显示,最优处方胶凝温度为35.3 ℃,室温下通针性良好。于4 ℃放置10 d,制剂无明显沉降,无颗粒聚集现象。
2.3.1 检测波长与色谱条件
精密称取TAA标准品适量,用乙醇溶解并稀释成10 μg·mL-1标准品溶液,在180~400 nm波长范围内扫描。结果显示,TAA标准品在240 nm波长处吸收最强,而且处方中其他辅料在此条件下无干扰。
色谱条件:C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;流动相为甲醇:水=75:25;柱温25 ℃;检测波长为240 nm;进样量20 μL。在此条件下,TAA色谱峰与其他组分峰能达到基线分离,保留时间约8.7 min,理论板数不低于4 000。
2.3.2 专属性实验
分别取适量阴性溶液、对照品溶液和样品溶液,按“2.3.1”项色谱条件进样分析,色谱图见
图1 TAA温敏凝胶累积释药曲线图
Fig.1 Curves of cumulative drug release of TAA thermosensitive hydrogel
2.3.3 TAA标准曲线的制备
分别量取TAA对照品溶液0.1,0.5,1.5,2.5,3.2,5.0 mL,置于10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,按“2.3.1”项色谱条件进样分析,测定峰面积。以峰面积(
2.3.4 精密度实验
按“2.3.1”项色谱条件,取TAA对照品溶液,置于10 mL量瓶中,用流动相超声溶解后定容,配制成低、中、高浓度(5,50,100 μg·mL-1)的药物溶液,测定日内精密度和日间精密度。结果,日内精密度分别为0.37%,0.21%,0.45%(
2.3.5 重复性实验
按照最优处方配比和“2.1”项标准制备TAA温敏凝胶(浓度:4 mg·mL-1,批号:20150403),精密量取6份,每份1 mL,分别置于100 mL量瓶中,用流动相溶解稀释并定容,按“2.3.1”项色谱条件进样分析,测定峰面积(A),根据回归方程计算其含量。结果样品中TAA含量RSD=1.06%(
2.3.6 稳定性实验
精密称取适量的TAA温敏凝胶(4 mg·mL-1),分别置于10 mL量瓶中,加流动相溶解稀释成5,50,100 μg·mL-1的药物凝胶溶液。放置在4 ℃下储存,分别在0,2,6,14,30 d时取样,按“2.3.1”项色谱条件进样分析,测定峰面积(
2.3.7 加样回收率实验
精密称取空白凝胶共9份,每份1 mL,置于10 mL量瓶中,每3份分别向其中加入100 μg·mL-1的TAA标准品溶液2,4,8 mL,用流动相溶解稀释并定容,按“2.3.1”项色谱条件进样分析,测定峰面积(
2.3.8 含药量测定
分别取3个不同批次的TAA温敏凝胶(浓度4 mg·mL-1,批号:20150403,20150415,20150419)各1 mL,用流动相溶解稀释并定容,按“2.3.1”项色谱条件进样分析,测定峰面积,根据回归方程计算其含量。结果其含药量分别为3.74,3.78,3.82 mg·mL-1,RSD=1.05%。
基于模拟人体关节腔环境,TAA温敏凝胶的体外释放行为考察[5]采用无膜溶出法。根据TAA在不同浓度(0.5%~2.0%)十二烷基磺酸钠中的溶解度测定结果,选取满足漏槽条件的含2%十二烷基磺胺酸钠的0.9%氯化钠溶液作为制剂溶出的释放介质。按照上述最优处方制备TAA温敏凝胶(4 mg·mL-1),精密称取1 mL置于50 mL具塞试管中,在(35.0±0.5) ℃恒温水浴锅中放置一段时间,待其胶凝,加入释放介质45 mL,置于恒温震荡器中,频率60 r·min-1。于第4,8,12小时,第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16天时倒出全部释放介质,同时补充同样体积的新鲜介质。将取出的释放介质以2 000 r·min-1(
表6 TAA温敏凝胶体外释药的拟合模型
Tab.6
Fitting equation of
温敏凝胶基质——两亲性三嵌段共聚物PLGA-PEG-PLGA[7]具有良好的生物相容性和生物降解性,且缓释效果强于一般的高分子聚合物材料。另外,它的两亲性也能对TAA有一定的增溶作用,有利于改善混悬制剂的分散性。处方中的助悬剂——黄原胶[8]是目前国际上集增稠、乳化、稳定于一体的,性能优越的生物胶。另外,将其运用于关节腔注射,还能够增加药物在腔道中的黏附性,减少由于关节活动带来的药物损失,明显提高生物利用度。
笔者曾尝试采用透析袋法进行TAA温敏凝胶的体外释放实验,但释放结果不理想。考虑可能是由于PLGA-PEG-PLGA为高分子材料,对透析袋的孔隙造成一定的堵塞而使药物不能释放完全[9],所以对此类制剂的药物采用无膜释放可相对真实地反映其释放过程。
体外释放行为的考察虽然尽量模拟体内释药环境,但是TAA为难溶性药物,体内外药物吸收机制必然有显著差异,而且由于关节腔环境的特殊性,故还需进一步考察体内释药,探究释药机制。
由于TAA温敏凝胶为关节腔注射,故需满足注射制剂的无菌要求。常用的灭菌方法有:高温消毒灭菌、热压灭菌、流通蒸汽灭菌、紫外线灭菌、辐照灭菌、过滤除菌等,其中热压灭菌是目前注射剂生产中常用的灭菌方法。但PLGA-PEG-PLGA的凝胶-沉淀相变温度为50~70 ℃,在高温和高湿条件下均不稳定,高温、热压及流通蒸汽灭菌凝胶基质变性,而且紫外线灭菌和过滤除菌法达不到注射制剂的灭菌要求,故笔者选择采取可在常温下进行且穿透力较强的60Co照射的γ射线辐射灭菌[10]。
The authors have declared that no competing interests exist.
