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医药导报, 2016, 35(5): 514-517
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2016.05.021
双波长高效液相色谱梯度洗脱法同时测定黎峒丸中4种成分含量*
Simultaneous Determination of Four Kinds of Component Contents in Litong Pill by Double-wavelength HPLC
孔沈燕, 李娴

摘要:

目的

建立双波长高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱法同时测定黎峒丸中新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素含量。

方法

采用HPLC法,C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为甲醇-乙腈(4:1),流动相B为0.2%磷酸溶液,梯度洗脱;流速1.1 mL·min-1;检测波长360 nm(新藤黄酸和藤黄酸),280 nm(儿茶素和表儿茶素)。

结果

根据回归方程,4种成分线性范围分别为新藤黄酸5.85~117.00 μg·mL-1(r=0.999 5)、藤黄酸8.95~179.00 μg·mL-1(r=0.999 8)、儿茶素6.90~138.00 μg·mL-1(r=0.999 7)、表儿茶素5.30~106.00 μg·mL-1(r=0.999 9);平均加样回收率(n=6)分别为新藤黄酸97.82%(RSD=1.21%)、藤黄酸98.72%(RSD=1.30%)、儿茶素96.96%(RSD=0.84%)、表儿茶素99.26%(RSD=1.46%)。

结论

该方法操作简便、准确,重复性好,可用于黎峒丸的质量控制。

关键词: 黎峒丸 ; 新藤黄酸 ; 藤黄酸 ; 儿茶素 ; 表儿茶素 ; 藤黄 ; 儿茶 ; 含量测定

Abstract:

Objective

To develop a double-wavelength HPLC method for the simultaneous determination of neogambogic acid, gambogic acid, (+)-catechin and L-epicatechin in Litong pill.

Methods

The quantitative analysis was carried out on C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm).A linear elution of methanol-acetonitrile (4:1) and 0.2% phosphoric acid solution was adopted at the flow rate of 1.1 mL·min-1, with the detection wavelength set at 360 nm for neogambogic acid and gambogic acid, and at 280 nm for (+)-catechin and L-epicatechin.

Results

The linear ranges of neogambogic acid, gambogic acid, (+)-catechin and L-epicatechin were 5.85-117.00 μg·mL-1 (r=0.999 5), 8.95-179.00 μg·mL-1 (r=0.999 8), 6.90-138.00 μg·mL-1 (r=0.999 7), and 5.30-106.00 μg·mL-1 (r=0.999 9), respectively.The average recoveries were 97.82% (RSD=1.21%), 98.72% (RSD=1.30%), 96.96% (RSD=0.84%) and 99.26% (RSD=1.46%) for neogambogic acid, gambogic acid, (+)-catechin and L-epicatechin, respectively.

Conclusion

The method is simple, accurate, reproducible and may be used for the simultaneous determination of neogambogic acid, gambogic acid, (+)-catechin and L-epicatechin in Litong pill.

Key words: pill ; Neogambogic acid ; Gambogic acid ; (+)-Catechin ; -epicatechin ; ; Catechu ; Determination

黎峒丸收载于国家药品标准《中药成方制剂》第15册,由藤黄(制)、儿茶等14味药物组成,该制剂具有活血祛瘀、消肿镇痛的疗效,临床上应用于治疗跌打损伤、瘀血肿痛、闪腰岔气,痈肿疮毒等症[1-2]。藤黄和儿茶为方中的主要药物。儿茶具有活血止痛、止血生肌、收湿敛疮、清肺化痰的功效,可用于跌扑伤痛、外伤出血、吐血衄血、疮疡不敛、湿疹、湿疮、肺热咳嗽等症的治疗。藤黄具有消肿排脓、散瘀血、杀虫、止痒的功效,可用于痈疽肿毒、顽癣、恶疮、跌打损伤、烫火伤等症的治疗。新藤黄酸和藤黄酸为藤黄的主要成分,儿茶素、表儿茶素为儿茶的主要成分,原部颁标准未对方中的任何药物进行定性或定量测定,不能有效地控制产品的质量和疗效,笔者采用双波长高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱法对黎峒丸中藤黄所含新藤黄酸、藤黄酸和儿茶所含儿茶素、表儿茶素进行含量测定,为完善该制剂质量标准提供参考。

1 仪器与试药
1.1 仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪,配有G1311A四元泵、G1330B自动进样器、恒温器、G1322A脱气机、G1315B可变波长检测器、Chemstation色谱工作站;VS-100UE恒温超声波提取机(无锡沃信仪器有限公司)。

1.2 试药

新藤黄酸对照品(含量:98.0%,批号:93772-31-7)、藤黄酸对照品(含量:98.0%,批号:2752-65-0)购于宝鸡市辰光生物科技有限公司;儿茶素(含量:97.2%,批号:110877-201203)、表儿茶素(含量:100.0%,批号:110878-200102)均购于中国食品药品检定研究院。黎峒丸(杭州胡庆余堂药业有限公司,批号:1315501,1315502,1315503);甲醇、乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯。

2 方法与结果
2.1 色谱条件

依利特C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为甲醇-乙腈(4:1),流动相B为0.2%磷酸溶液,梯度洗脱(0~12 min,75.0%A;~30 min,75.0%→65.0%A;~44 min,65.0%A→50.0%A;~50 min,50.0%A→75.0%A)[3-7];新藤黄酸和藤黄酸检测波长为360 nm(0~32 min)[8-9],儿茶素和表儿茶素检测波长为280 nm(32~50 min)[10-14];流速为1.1 mL·min-1;进样量20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液制备

用75%甲醇分别配制新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素对照品储备液,浓度依次为0.585,0.895,0.690,0.530 mg·mL-1。再分别依次取对照品储备液4.0,6.0,4.0,3.0 mL,置100 mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,得到混合对照品溶液,即新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素与表儿茶素质量浓度依次为0.023 4,0.053 7,0.027 6,0.015 9 mg·mL-1

2.2.2 样品溶液的制备

取本品适量,研细,取1.0 g,精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇50 mL,密塞,称定质量,超声处理(200 W,频率20 kHz)45 min,放冷至室温,再称定质量,用75%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 mL,置50 mL量瓶中,加入75%甲醇稀释至刻度,摇匀,作为样品溶液。

2.2.3 阴性溶液制备

按照黎峒丸处方比例称取除藤黄(制)的其余药味和除儿茶的其余药味各1份,分别制成藤黄空白样品和儿茶空白样品,按照“2.2.2”项样品溶液的制备方法制成藤黄阴性溶液和儿茶阴性溶液。

2.3 系统适应性实验

分别取阴性溶液、样品溶液、混合对照品溶液,按“2.1”项色谱条件进样测定。此系统条件下所测组分与其他组分分离效果良好,理论板数按表儿茶素计不得低于3 500,分离度均>2.0,色谱图见图1。

图1 4种溶液的HPLC色谱图
A.儿茶阴性溶液;B.藤黄阴性溶液;C.混合对照品溶液;D.样品溶液;1.新藤黄酸;2.藤黄酸;3.儿茶素;4.表儿茶素

Fig.1 HPLC chromatograms of four kinds of solutions
A.negative sample without Catechu;B.negative sample without roasted Cutti Cambogia;C.mixed reference solution;D.sample;1.neogambogic acid;2.gambogic acid;3.(+)-catechin;4.L-epicatechin

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项各对照品储备溶液0.1,0.2,0.5,1.0,2.0 mL,分别置于5个10 mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀。按“2.1”项色谱条件进行分析测定,以峰面积A为纵坐标,对照品质量浓度C为横坐标,绘制标准曲线。结果:新藤黄酸回归方程为A=4.049 2×104C-248.5,r=0.999 5,线性范围为5.85~117.00 μg·mL-1;藤黄酸回归方程为A=7.511 3×104C+481.7,r=0.999 8,线性范围为8.95~179.00 μg·mL-1;儿茶素的回归方程为A=3.864 6×104C+217.8,r=0.999 7,线性范围为6.90~138.00 μg·mL-1;表儿茶素回归方程为A=1.679 1×104C+201.7,r=0.999 9,线性范围为5.30~106.00 μg·mL-1。结果表明,新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素在各自的线性范围内,所测组分质量浓度与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度实验

取“2.2.1”项混合对照品溶液,按照“2.1”项色谱条件,精密吸取混合对照品溶液20 μL,连续重复进样6次,测定峰面积,计算得新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素RSD分别为1.04%,0.76%,0.91%,1.21%,表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

称取同一批号样品,按“2.2.2”项方法制备样品溶液6份,按照“2.1”项色谱条件依法进样测定,计算各成分含量和RSD,新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素的RSD分别为0.86%,0.59%,1.02%和0.64%。表明该方法重复性较好。

2.7 稳定性实验

精密吸取同一样品溶液,在室温下放置0,2,4,6,8,12 h后,每次进样20 μL,测定其峰面积值,新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素的RSD分别为1.03%,0.75%,1.17%,0.49%。表明样品溶液12 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率实验

称取已知含量的黎峒丸(新藤黄酸11.9 mg·g-1、藤黄酸27.2 mg·g-1、儿茶素13.5 mg·g-1、表儿茶素8.2 mg·g-1)适量,研细,取0.1 g,精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,精密加入混合对照品溶液50 mL,称定质量,超声处理(200 W,频率20 kHz)45 min,放冷,再称定质量,用75%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 mL,置10 mL量瓶中,加入75%甲醇稀释至刻度,摇匀,作为加样样品溶液。按照“2.1”项色谱条件进样测定,并计算加样回收率。结果新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素、表儿茶素平均回收率分别为97.82%,98.72%,96.96%,99.26%;RSD分别为1.21%,1.30%,0.84%,1.46%,见表1。

表1 新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素加样回收率实验结果
Tab.1 Results of recovery test on neogambogic acid,gambogic acid,(+)-catechin and L-epicatechin
成分 称取量/
g
原有量 加入量 测得量 回收率/
%
mg
新藤黄酸 0.099 3 1.182 1.170 2.324 97.61
0.101 7 1.210 1.170 2.376 99.66
0.100 9 1.201 1.170 2.341 97.44
0.098 6 1.173 1.170 2.299 96.24
0.101 1 1.203 1.170 2.357 98.63
0.102 9 1.225 1.170 2.364 97.35
藤黄酸 0.099 3 2.701 2.685 5.381 99.81
0.101 7 2.766 2.685 5.417 98.73
0.100 9 2.744 2.685 5.376 98.03
0.098 6 2.682 2.685 5.369 100.07
0.101 1 2.750 2.685 5.411 99.11
0.102 9 2.799 2.685 5.392 96.57
儿茶素 0.099 3 1.341 1.380 2.681 97.10
0.101 7 1.373 1.380 2.701 96.23
0.100 9 1.362 1.380 2.694 96.52
0.098 6 1.331 1.380 2.689 98.41
0.101 1 1.365 1.380 2.706 97.17
0.102 9 1.389 1.380 2.718 96.30
表儿茶素 0.099 3 0.814 0.795 1.612 100.38
0.101 7 0.834 0.795 1.627 99.75
0.100 9 0.827 0.795 1.595 96.60
0.098 6 0.808 0.795 1.607 100.50
0.101 1 0.829 0.795 1.621 99.62
0.102 9 0.844 0.795 1.629 98.74

表1 新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery test on neogambogic acid,gambogic acid,(+)-catechin and L-epicatechin

2.9 样品测定

取黎峒丸3批,按“2.2.2”项样品溶液制备方法,按“2.1”项色谱条件测定本品中新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素含量,结果见表2。

表2 3批黎峒丸中4种成分含量测定结果
Tab.2 Results of content determination on four kinds of component in three batches of Litong pill mg·g-1,n=3
批号 新藤黄酸 藤黄酸 儿茶素 表儿茶素
1315501 11.9 27.2 13.5 8.2
1315502 12.4 29.5 12.6 7.9
1315503 12.1 26.7 13.9 8.6

表2 3批黎峒丸中4种成分含量测定结果

Tab.2 Results of content determination on four kinds of component in three batches of Litong pill mg·g-1,n=3

3 讨论
3.1 提取方法的选择

使用50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇分别超声提取1 h(200 W,频率20 kHz)和加热回流提取1 h进行提取效果比较,结果显示75%\甲醇超声提取与加热回流提取效果相当,考虑到实验操作的简便性,选取75%甲醇超声提取;选取75%甲醇超声提取(200 W,频率20 kHz)30,45 和60 min,考察超声提取时间对提取效率的影响,结果表明超声提取30 min,新藤黄酸和藤黄酸含量明显低于超声提取45和60 min,而超声提取45和60 min各组分含量相当,故选取75%甲醇超声提取(200 W,频率20 kHz)

45 min作为样品溶液的最佳提取方案。
3.2 对待测成分干扰的考察

分别精密吸取混合对照品溶液、样品溶液、藤黄阴性溶液及儿茶阴性溶液各20 μL,按“2.1”项色谱条件测定,结果在与新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素对照品色谱图相应的保留时间处,样品溶液色谱图中有吸收峰;而藤黄阴性溶液色谱图中未显示新藤黄酸和藤黄酸吸收峰;儿茶阴性溶液色谱图中未显示儿茶素和表儿茶素吸收峰。结果表明其他药味对待测成分无干扰。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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黎峒丸
新藤黄酸
藤黄酸
儿茶素
表儿茶素
藤黄
儿茶
含量测定

pill
Neogambogic acid
Gambogic acid
(+)-Catechin
-epicatechin
Catechu
Determination

作者
孔沈燕
李娴

KONG Shenyan
LI Xian