目的
建立双波长高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱法同时测定黎峒丸中新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素含量。
方法
采用HPLC法,C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为甲醇-乙腈(4:1),流动相B为0.2%磷酸溶液,梯度洗脱;流速1.1 mL·min-1;检测波长360 nm(新藤黄酸和藤黄酸),280 nm(儿茶素和表儿茶素)。
结果
根据回归方程,4种成分线性范围分别为新藤黄酸5.85~117.00 μg·mL-1(
结论
该方法操作简便、准确,重复性好,可用于黎峒丸的质量控制。
Objective
To develop a double-wavelength HPLC method for the simultaneous determination of neogambogic acid, gambogic acid, (+)-catechin and
Methods
The quantitative analysis was carried out on C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm).A linear elution of methanol-acetonitrile (4:1) and 0.2% phosphoric acid solution was adopted at the flow rate of 1.1 mL·min-1, with the detection wavelength set at 360 nm for neogambogic acid and gambogic acid, and at 280 nm for (+)-catechin and
Results
The linear ranges of neogambogic acid, gambogic acid, (+)-catechin and
Conclusion
The method is simple, accurate, reproducible and may be used for the simultaneous determination of neogambogic acid, gambogic acid, (+)-catechin and
黎峒丸收载于国家药品标准《中药成方制剂》第15册,由藤黄(制)、儿茶等14味药物组成,该制剂具有活血祛瘀、消肿镇痛的疗效,临床上应用于治疗跌打损伤、瘀血肿痛、闪腰岔气,痈肿疮毒等症[1-2]。藤黄和儿茶为方中的主要药物。儿茶具有活血止痛、止血生肌、收湿敛疮、清肺化痰的功效,可用于跌扑伤痛、外伤出血、吐血衄血、疮疡不敛、湿疹、湿疮、肺热咳嗽等症的治疗。藤黄具有消肿排脓、散瘀血、杀虫、止痒的功效,可用于痈疽肿毒、顽癣、恶疮、跌打损伤、烫火伤等症的治疗。新藤黄酸和藤黄酸为藤黄的主要成分,儿茶素、表儿茶素为儿茶的主要成分,原部颁标准未对方中的任何药物进行定性或定量测定,不能有效地控制产品的质量和疗效,笔者采用双波长高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱法对黎峒丸中藤黄所含新藤黄酸、藤黄酸和儿茶所含儿茶素、表儿茶素进行含量测定,为完善该制剂质量标准提供参考。
Agilent 1200 高效液相色谱仪,配有G1311A四元泵、G1330B自动进样器、恒温器、G1322A脱气机、G1315B可变波长检测器、Chemstation色谱工作站;VS-100UE恒温超声波提取机(无锡沃信仪器有限公司)。
新藤黄酸对照品(含量:98.0%,批号:93772-31-7)、藤黄酸对照品(含量:98.0%,批号:2752-65-0)购于宝鸡市辰光生物科技有限公司;儿茶素(含量:97.2%,批号:110877-201203)、表儿茶素(含量:100.0%,批号:110878-200102)均购于中国食品药品检定研究院。黎峒丸(杭州胡庆余堂药业有限公司,批号:1315501,1315502,1315503);甲醇、乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯。
2.2.1 混合对照品溶液制备
用75%甲醇分别配制新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素对照品储备液,浓度依次为0.585,0.895,0.690,0.530 mg·mL-1。再分别依次取对照品储备液4.0,6.0,4.0,3.0 mL,置100 mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,得到混合对照品溶液,即新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素与表儿茶素质量浓度依次为0.023 4,0.053 7,0.027 6,0.015 9 mg·mL-1。
2.2.2 样品溶液的制备
取本品适量,研细,取1.0 g,精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇50 mL,密塞,称定质量,超声处理(200 W,频率20 kHz)45 min,放冷至室温,再称定质量,用75%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 mL,置50 mL量瓶中,加入75%甲醇稀释至刻度,摇匀,作为样品溶液。
2.2.3 阴性溶液制备
按照黎峒丸处方比例称取除藤黄(制)的其余药味和除儿茶的其余药味各1份,分别制成藤黄空白样品和儿茶空白样品,按照“2.2.2”项样品溶液的制备方法制成藤黄阴性溶液和儿茶阴性溶液。
分别取阴性溶液、样品溶液、混合对照品溶液,按“2.1”项色谱条件进样测定。此系统条件下所测组分与其他组分分离效果良好,理论板数按表儿茶素计不得低于3 500,分离度均>2.0,色谱图见
分别精密吸取“2.2.1”项各对照品储备溶液0.1,0.2,0.5,1.0,2.0 mL,分别置于5个10 mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀。按“2.1”项色谱条件进行分析测定,以峰面积
取“2.2.1”项混合对照品溶液,按照“2.1”项色谱条件,精密吸取混合对照品溶液20 μL,连续重复进样6次,测定峰面积,计算得新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素RSD分别为1.04%,0.76%,0.91%,1.21%,表明仪器精密度良好。
称取同一批号样品,按“2.2.2”项方法制备样品溶液6份,按照“2.1”项色谱条件依法进样测定,计算各成分含量和RSD,新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素的RSD分别为0.86%,0.59%,1.02%和0.64%。表明该方法重复性较好。
精密吸取同一样品溶液,在室温下放置0,2,4,6,8,12 h后,每次进样20 μL,测定其峰面积值,新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素的RSD分别为1.03%,0.75%,1.17%,0.49%。表明样品溶液12 h内稳定性良好。
称取已知含量的黎峒丸(新藤黄酸11.9 mg·g-1、藤黄酸27.2 mg·g-1、儿茶素13.5 mg·g-1、表儿茶素8.2 mg·g-1)适量,研细,取0.1 g,精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,精密加入混合对照品溶液50 mL,称定质量,超声处理(200 W,频率20 kHz)45 min,放冷,再称定质量,用75%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 mL,置10 mL量瓶中,加入75%甲醇稀释至刻度,摇匀,作为加样样品溶液。按照“2.1”项色谱条件进样测定,并计算加样回收率。结果新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素、表儿茶素平均回收率分别为97.82%,98.72%,96.96%,99.26%;RSD分别为1.21%,1.30%,0.84%,1.46%,见
使用50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇分别超声提取1 h(200 W,频率20 kHz)和加热回流提取1 h进行提取效果比较,结果显示75%\甲醇超声提取与加热回流提取效果相当,考虑到实验操作的简便性,选取75%甲醇超声提取;选取75%甲醇超声提取(200 W,频率20 kHz)30,45 和60 min,考察超声提取时间对提取效率的影响,结果表明超声提取30 min,新藤黄酸和藤黄酸含量明显低于超声提取45和60 min,而超声提取45和60 min各组分含量相当,故选取75%甲醇超声提取(200 W,频率20 kHz)
分别精密吸取混合对照品溶液、样品溶液、藤黄阴性溶液及儿茶阴性溶液各20 μL,按“2.1”项色谱条件测定,结果在与新藤黄酸、藤黄酸、儿茶素和表儿茶素对照品色谱图相应的保留时间处,样品溶液色谱图中有吸收峰;而藤黄阴性溶液色谱图中未显示新藤黄酸和藤黄酸吸收峰;儿茶阴性溶液色谱图中未显示儿茶素和表儿茶素吸收峰。结果表明其他药味对待测成分无干扰。
The authors have declared that no competing interests exist.