高效液相色谱法测定苦参碱醇质体温敏凝胶中苦参碱含量

黄正德¹^,, 林如文², 刘小平²

1.湖北省中医院药剂科,武汉 430061

2.武汉理工大学化生学院制药工程系,武汉 430070

HUANG Zhengde¹^,, LIN Ruwen², LIU Xiaoping²

1.Department of Pharmacy, Hubei Provincial Hospital of TCM, Wuhan 430061,China

2.Department of Pharmaceutical Engineering,Institute of Chemical Biology,Wuhan University of Technology,Wuhan 430070,China

作者简介黄正德(1978-),男,湖北宜昌人,主管药师,研究方向:中药学和药事管理。电话:027-88929346,E-mail:1473208193@qq.com。

中图分类号: R286 文献标识码: B 文章编号: 1004-0781(2016)05-0521-03

摘要:

目的

建立高效液相色谱(HPLC)法测定苦参碱醇质体温敏凝胶中苦参碱含量。

方法

采用YMC-Pack NH₂柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以乙腈-乙醇(9:1)为流动相,流速为0.8 mL·min^-1,柱温(25±2) ℃,检测波长为215 nm。

结果

苦参碱在1.00~ 100.00 μg·mL^-1范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系(R²=0.999 2),低、中、高浓度苦参碱平均加样回收率分别为98.16%,98.15%,98.00%,RSD为分别为0.30%,0.69%,0.71%。

结论

该方法操作简单易行,结果灵敏准确,专属性强,精密度高,稳定性好,重复性好,能够用于苦参碱醇质体温敏凝胶中苦参碱的含量测定。

关键词: 苦参碱醇质体温敏凝胶 ; 色谱法 ; 高效液相 ; 含量测定

Abstract:

Objective

To establish an HPLC method for determination of matrine in matrine ethosome thermosensitive gels.

Methods

Matrine was detected in matrine ethosome thermosensitive gels by using a YMC-Pack NH₂ column (4.6 mm×150 mm, 5 μm), with the mobile phase containing acetonitrile-ethanol (9:1).The flow rate was 0.8 mL·min^-1,the column temperature (25±2) ℃ and the UV detection wavelength 215 nm.

Results

The peak area correlated with matrine concentration within the range of 1.00-100.00 μg·mL^-1 linearly,and the average correlation coefficient was 0.999 2.The average recoveries rate of low, medium and high concentration of matrine were 98.16%,98.15%,98.00%, respectively,and the RSD were 0.30%,0.69%,0.71%, respectively.

Conclusion

The method is simple, sensitive and accurate.With the advantages of specificity, high precision, good stability and repeatability, the HPLC method can be used for the determination of matrine in matrine ethosome thermosensitive gels.

Key words: Matrine ethosome thermosensitive gels ; Chromatography ; high performance liquid ; Determination

苦参碱是从豆科植物苦参、苦豆子、广豆根等中草药分离出来的主要活性成分,属于四环喹嗪啶类生物碱,研究发现苦参碱具有多种药理活性,如抗菌、抗炎、抗风湿、抗肿瘤、抗变态反应、抗病毒、抗寄生虫、抗心律失常、消肿利尿、抗肝纤维化、免疫及生物反应调节作用等,可用于妇科炎症、关节炎、肿瘤等的治疗^[1-2]。醇质体是一种由磷脂、高浓度低相对分子质量的醇、水组成的具有脂质双分子层结构的新型柔性脂质体,具有高包封率、高变形性的优点,能有效地运送药物通过角质层进入皮肤更深层甚至血液循环,尤其适合作为外用给药和经皮给药的载体^[3-5]。温度敏感型原位凝胶是一种对温度变化敏感的智能型高分子聚合物凝胶,能够随贮藏条件、用药部位的温度变化发生相转变,形成非化学交联的半固体凝胶。利用醇质体和温度敏感型原位凝胶这一复合给药载体,以液体形式给药后,能迅速在皮肤、黏膜表面铺展开,形成半固体凝胶层。由于凝胶层作用,使药物滞留在患处的时间延长,从而有效地发挥药效。同时利用醇质体高效的经皮渗透性,使得苦参碱更好地通过黏膜,提高治疗效果。笔者建立高效液相色谱(HPLC)法测定苦参碱醇质体温敏凝胶中的苦参碱,为温敏凝胶中苦参碱的含量控制以及体外释放度的研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

FA2104N电子分析天平(上海天平仪器厂,感量:0.01 mg);DF-101S恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂);LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津制作所)。

1.2 试药

苦参碱(杭州中香化学有限公司,含量≥98%);苦参碱对照品(中国食品药品检定研究院,含量≥99.5%,批号:110805-200508);泊洛沙姆407(德国BASF公司,WPTF533B);泊洛沙姆188(德国BASF公司,WPEE587E);卵磷脂(国药集团化学试剂有限公司,生化试剂);乙腈、乙醇为色谱纯(国药集团化学试剂公司),其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择

精密称取苦参碱对照品10.01 mg于100 mL量瓶中,用适量流动相乙腈:乙醇(9:1)超声溶解,加入流动相稀释至刻度,配成100.1 μg·mL^-1苦参碱对照品溶液。在200~400 nm波长范围内用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描,结果显示苦参碱溶液在(215±2) nm处有最大吸收。

2.2 色谱条件

色谱柱:YMC-Pack NH₂(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈-乙醇(9:1);流速:0.8 mL·min^-1;检测波长215 nm;柱温:(25±2) ℃;进样量:20 μL。

2.3 醇质体的制备

2.3.1 苦参碱醇质体的制备

采用醇注入法制备^[6]。精密称取处方量的苦参碱溶于处方量的醋酸盐缓冲液中(pH值=4.5),另取处方量卵磷脂溶于处方量乙醇与丙二醇混合溶液中,(37±1) ℃、900 r·min^-1持续搅拌,用4号针头缓慢匀速地将卵磷脂醇溶液注入苦参碱醋酸盐缓冲液中,后孵化30 min,即得。

2.3.2 空白醇质体的制备

精密称取处方量卵磷脂溶于处方量乙醇与丙二醇混合溶液中,量取处方量醋酸盐缓冲液(pH值=4.5),其他操作同“2.3.1”项。

2.4 溶液的制备

2.4.1 对照品溶液制备

精密称取苦参碱对照品10.01 mg,置于100 mL量瓶中,用适量流动相超声溶解,加流动相稀释至刻度并摇匀,得100.1 μg·mL^-1苦参碱溶液,过一次性微孔滤膜(孔径0.22 μm),备用。

2.4.2 样品溶液制备

精密称取处方量的壳聚糖溶液(使最终浓度为0.08%)于具塞玻璃瓶中,放入冰箱中低温(4 ℃)贮藏,冷却至4 ℃,加入处方量的甘油,再加入处方量的泊洛沙姆407和188混合物,补足处方量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值=4.5),最后加入处方量的苦参碱醇质体溶液,放入冰箱中低温(4 ℃)过夜,使聚合物充分溶胀后,搅拌均匀,再放入冰箱中低温(4 ℃)过夜除气泡,得到乳清色的苦参碱醇质体温敏凝胶溶液。

取凝胶溶液0.2 g于10 mL量瓶中,加流动相定容至刻度,摇匀后过孔径0.22 μm微孔滤膜,取续滤液即得。

2.4.3 阴性溶液制备

把苦参碱醇质体溶液用空白醇质体溶液替代,其他操作与“2.4.2”项相同。

2.5 苦参碱标准曲线绘制

精密量取苦参碱对照品溶液0.1,1.0,2.0,4.0,6.0及8.0 mL分别置于10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度并摇匀,分别得到苦参碱的浓度为1.00,10.01,20.02,40.04,60.06,80.08及100.10 μg·mL^-1的溶液。分别过一次性微孔滤膜(孔径0.22 μm)后,用进样针精密吸取20 μL,按上述色谱条件进行分析,测定峰面积(A)。以浓度(C,μg·mL^-1)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,进行线性回归,得回归方程为:A=31 939C+9 356.2,R²=0.999 2,结果表明苦参碱在1.00~100.00 μg·mL^-1范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.6 专属性实验

精密吸取对照品溶液、阴性溶液和样品溶液,按上述色谱条件分别进样20 μL,所得液相色谱图见图1。

图1 3种溶液的HPLC图谱
A.阴性溶液;B.对照品溶液; C.样品溶液;1.苦参碱

Fig 1 HPLC chromatograms of three kinds of solutions
A.negative solution;B.reference solution;C.sample solution;1.matrine

由图1可知,苦参碱对照品在该色谱条件下约4.4 min出峰,且其他成分对苦参碱的测定未产生干扰。说明该方法具有良好的专属性。

2.7 精密度实验

按上述色谱条件,精密吸取苦参碱样品溶液(60.06 μg·mL^-1)20 μL,注入液相色谱仪,测定各个峰面积,重复进样5次,计算RSD=1.08%。结果显示苦参碱在该色谱条件下的检测方法精密度良好。

2.8 稳定性实验

按上述色谱条件,分别于制备完成后0,2,4,6,12,24,48 h精密吸取苦参碱样品溶液(60.06 μg·mL^-1)20 μL,注入液相色谱仪,测定其峰面积,计算RSD=1.10%,表明苦参碱样品溶液在48 h内稳定。

2.9 回收率实验

称取处方量的药用辅料,制备空白醇质体温敏凝胶溶液,精密称取空白智能水凝胶溶液0.2 g,共9份,每3份分别加入苦参碱对照品1.03,3.07,5.12 mg,超声使其完全溶解,按“2.4”项方法同法制备样品溶液,同时按上述色谱条件,测定其含量。结果见表1。苦参碱加样回收率实验的平均回收率符合HPLC的测定要求。

加入量	测得量		回收率	平均回收率	RSD
1.03	1.011	98.16
1.03	1.008	97.86	98.16	0.30
1.03	1.014	98.45
3.07	3.032	98.76
3.07	3.017	98.27	98.15	0.69
3.07	2.991	97.43
5.12	5.052	98.67
5.12	4.981	97.28	98.00	0.71
5.12	5.020	98.05

表1 苦参碱加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery test on matrine

2.10 样品含量测定

分别取3个批号(20130915,20130922,20130929)的苦参碱醇质体温敏凝胶样品0.2 g,于10 mL量瓶中,用流动相(乙腈:乙醇=9:1)定容至刻度,摇匀后过孔径0.22 μm微孔滤膜,精密吸取20 μL注入高效液相色谱仪,色谱条件按“2.2”项所示,测其含量,结果见表2。

批号	含量/(mg·g^-1)	RSD/%
20130915	2.83	1.02
20130922	2.75	0.73
20130929	2.72	0.94

表2 3批样品中苦参碱含量测定结果

Tab.2 Results of content determination of matrine in three batches of samples n=5

3 讨论

文献报道,HPLC法测定含苦参碱滴丸制剂,流动相采用乙腈-0.1%磷酸溶液(20:80)^[7],考虑到醇质体的特性,笔者采用乙腈-乙醇的混合溶剂作为流动相,实验以分离度作为考察指标,确定乙腈-乙醇的体积比为9:1时,此时峰型最好,分离度高。结果显示,该方法操作简单易行,结果灵敏准确,且具有专属性强、精密度高、稳定性好、重复性好等优点,故可用于测定苦参碱醇质体温敏凝胶中苦参碱的含量。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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苦参碱栓治疗阴道炎症的临床观察

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... 苦参碱是从豆科植物苦参、苦豆子、广豆根等中草药分离出来的主要活性成分,属于四环喹嗪啶类生物碱,研究发现苦参碱具有多种药理活性,如抗菌、抗炎、抗风湿、抗肿瘤、抗变态反应、抗病毒、抗寄生虫、抗心律失常、消肿利尿、抗肝纤维化、免疫及生物反应调节作用等,可用于妇科炎症、关节炎、肿瘤等的治疗^[1-2]. 醇质体是一种由磷脂、高浓度低相对分子质量的醇、水组成的具有脂质双分子层结构的新型柔性脂质体,具有高包封率、高变形性的优点,能有效地运送药物通过角质层进入皮肤更深层甚至血液循环,尤其适合作为外用给药和经皮给药的载体^[3-5].温度敏感型原位凝胶是一种对温度变化敏感的智能型高分子聚合物凝胶,能够随贮藏条件、用药部位的温度变化发生相转变,形成非化学交联的半固体凝胶.利用醇质体和温度敏感型原位凝胶这一复合给药载体,以液体形式给药后,能迅速在皮肤、黏膜表面铺展开,形成半固体凝胶层.由于凝胶层作用,使药物滞留在患处的时间延长,从而有效地发挥药效.同时利用醇质体高效的经皮渗透性,使得苦参碱更好地通过黏膜,提高治疗效果.笔者建立高效液相色谱(HPLC)法测定苦参碱醇质体温敏凝胶中的苦参碱,为温敏凝胶中苦参碱的含量控制以及体外释放度的研究提供参考. ...

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