杨桃根多糖片对糖尿病模型小鼠的降糖降脂作用

罗旭艳¹^,²^,, 杨欣², 王丽惠², 黄仁彬¹^,

1. 广西医科大学药学院,南宁 530021

2. 南宁市第五人民医院药剂科,南宁 530001

作者简介罗旭艳(1985 -),女,广西宜州人,药师 ,硕士,研究方向:生化药理学。E-mail:xuyanluo815@163.com。

通信作者黄仁彬(1955-),男,教授,博士生导师,研究方向:抗病毒性肝炎药物、抗老年痴呆药物、抗心血管病药物。电话:0771-5358272,E-mail:huangrenbin518@163.com。

基金资助: 广西自然科学基金资助项目(桂科自0832013Z)

中图分类号: R286 文献标识码: A 文章编号: 1004-0781(2016)08增-0001-03

摘要:

目的观察杨桃根多糖片对链脲佐菌素(STZ)所致糖尿病小鼠血糖(BG)和血脂的影响。方法将实验小鼠随机分为6组:正常对照组、模型对照组、二甲双胍组和杨桃根多糖大、中、小剂量组。除正常对照组外,其他组均以腹腔注射STZ(150 mg·kg^-1)建立2型糖尿病小鼠模型。连续给药14 d后,分别测定各小鼠空腹血糖(FBG)和血脂。结果与模型对照组比较,杨桃根多糖大、中、小剂量组小鼠FBG及三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇均降低。结论杨桃根多糖片具有降低糖尿病小鼠模型BG水平、调节脂代谢紊乱的作用。

关键词: 杨桃根多糖片 ; 糖尿病 ; 血糖 ; 血脂

Abstract:

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种小鼠,雌雄各半,体质量20~23 g,由广西医科大学实验动物中心提供,无特定病原体(SPF)级动物,实验动物生产许可证:SCXK桂20090002,实验动物使用许可证:SYXK桂20090004。糖尿病(DM)模型小鼠适当控制摄食,每天一次喂食,自由饮水,自然采光,通风,每笼13只。

1.2 药品与试剂

杨桃根多糖片:由广西医科大学药理学教研室提供;链脲佐菌素(streptozotocin,STZ):美国Sigma公司;盐酸二甲双胍片(DMBG,每片0.25 g):北京京丰制药有限公司,批号:090711;柠檬酸(citric acid monohydrate,分析纯):成都市科龙化工试剂厂,批号:20091024;柠檬酸钠(sodium citrate,分析纯):成都市科龙化工试剂厂,批号:20090202;氯化钠(NaCl,分析纯):成都市科龙化工试剂厂,批号:20080422;聚山梨酯-80(Tween-80,化学纯):天津市太茂化学试剂厂,批号:0607081;血糖检测试剂盒:四川迈克科技有限责任公司,批号:0910121;三酰甘油(TG)测定试剂盒:四川迈克科技有限责任公司,批号:0610101;总胆固醇(TC)测定试剂盒:四川迈克科技有限责任公司,批号:0610131;低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒:长春汇力生物技术有限公司,批号:2010044;高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒:长春汇力生物技术有限公司,批号:2010044;冰乙酸(glacial acetic acid,分析纯):成都市科龙化工试剂厂,批号:20090802。

1.3 仪器

GSY-Ⅱ电热恒温水浴箱(北京市医疗设备厂),SHH-W21-Cr600型电热恒温水浴箱(北京长安科学仪器厂),AnKe TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂),TGL-16G-A高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),XW-80A 旋涡混合器(上海医科大学仪器厂),MA110型电子分析天平(上海第二天平仪器厂),HANGPING JA1003型上皿电子天平(上海天平仪器厂),电热恒温干燥箱(上海市跃进医疗器械厂),722S紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限责任公司),Thermo Forma 725超低温冰箱(Thermo Fornma 公司)。

1.4 DM模型建立及分组

小鼠不禁水、禁食12 h,预实验后,以STZ 150 mg·kg^-1对小鼠进行腹腔注射(STZ溶于0.1 mol·L^-1、pH值4.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中,现用现配,冰浴保存)。正常对照组小鼠腹腔注射等量的上述缓冲溶液。72 h后(小鼠采血前不禁水、禁食12 h)眼球后静脉丛采血50 μL,用离心机3 000 r·min^-1离心5 min,分离血清,用葡萄糖试剂盒测定小鼠空腹血糖(FBG),凡FBG≥11.1 mmol·L^-1视为DM动物模型。将成模的小鼠随机分为二甲双胍组、模型对照组及杨桃根多糖片大、中、小剂量组,每组10只。小鼠每日适当喂食1次,自由饮水^[1-3]。

1.5 给药剂量与方法

成模后第2天开始灌胃给药,正常对照组给予0.9%氯化钠溶液10 mL·kg^-1,模型对照组给予纯化水10 mL·kg^-1,二甲双胍组给予二甲双胍320 mg·kg^-1·d^-1,杨桃根多糖片大、中、小剂量组分别给予杨桃根多糖348.6,174.3,87.2 mg·kg^-1·d^-1,每天上午空腹给药1次,连续灌胃14 d^[4-7]。灌胃前将药物配成等体积不同浓度溶液(小鼠每10 g灌胃0.1 mL溶液)。模型对照组小鼠每10 g体质量灌胃0.1 mL空白溶剂,杨桃根多糖片组和二甲双胍组用前将药片研碎,用纯化水配制成混悬液。分别于给药前0,7,14 d取血测FBG,取血前禁食12 h,眼球后静脉丛采血,用葡萄糖试剂盒测定FBG值。

1.6 标本的采集

血清:在给药第 14天时,测定小鼠FBG后,小鼠摘眼球采血,待全血凝固,用离心机3 000 r·min^-1离心5 min,分离出血清,冷冻保存备用。肝脏:立即处死小鼠,取其肝脏,用冰0.9%氯化钠溶液清洗,滤纸吸干,称质量,取0.5 g于-80 ℃冰箱冷冻保存,用作生化指标测定。胸腺、脾脏:立即处死小鼠,取脾脏、胸腺,用冰0.9%氯化钠溶液清洗,用滤纸吸干,称质量。

1.7 观察指标

1.7.1 一般指标 ①观察小鼠的饮水量、进食量、大小便、毛发改变、精神活动等一般状态;②记录小鼠体质量变化和死亡情况。在实验进行的过程中每7 d用电子天平称小鼠体质量;③脏器指数:由实验记录各组小鼠的胸腺、脾脏质量,分别计算小鼠胸腺指数、脾脏指数^[5-6]。

计算公式为:

胸腺指数(mg·g^-1)= $\begin{matrix} \frac{胸腺质量}{体质量} \end{matrix}$ ×10

脾脏指数(mg·g^-1)= $\begin{matrix} \frac{脾脏质量}{体质量} \end{matrix}$ ×10

1.7.2 生化指标血糖的测定:造模成功的小鼠第2天开始灌胃给药,分别在给药第 7,14天眼球后静脉丛采血,用葡萄糖氧化酶法测定各组小鼠FBG。计算并统计分析杨桃根多糖片对DM小鼠FBG的影响。计算公式为:

样品血糖含量(mmol·L^-1)= $\begin{matrix} \frac{测定管吸光度}{标准管吸光度} \end{matrix}$ ×标准管浓度

降糖率= $\begin{matrix} \frac{用药前空腹血糖 - 用药后空腹血糖}{用药前空腹血糖} \end{matrix}$ ×100%

口服糖耐量试验测定:小鼠用药第14天时,禁食12 h,各组灌胃葡萄糖2.5 g·kg^-1,分别测定0,0.5,1,2 h各组小鼠的血糖,比较口服葡萄糖的耐量(OGTT)变化情况,并计算糖耐量的血糖浓度-时间曲线下面积(AUC)。

同法对正常小鼠灌胃给药,在用药第14天时,重复口服糖耐量试验,比较正常小鼠给药后的口服葡萄糖耐量(OGTT)变化情况,计算小鼠糖耐量AUC。

血糖曲线下面积=0.5×0 h血糖+0.5 h血糖+1.5×1 h血糖+2 h血糖^[7],其他生化指标有TG、TC、LDL-C、 HDL-C等。

1.7.3 胰腺、肝脏及肾组织形态学观察给药14 d实验结束,将小鼠处死后立即取胰腺和肾脏标本,浸入10%甲醛溶液中保存。标本常规乙醇逐级脱水,石蜡包埋,病理切片,苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜观察并采集图片。

1.8 统计学方法

所有数据用均数±标准差( $\begin{matrix} \overset{̅}{x} \end{matrix}$ ±s)表示,采用SPSS 13.0版统计软件对资料进行整理,组间均数比较采用方差分析。以 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组小鼠的一般状况

造模前小鼠精神状态良好,活动自如,皮毛光滑,饮水量、进食量及大小便正常,垫料干燥;造模成功后DM小鼠精神萎靡,出现多食、多饮、多尿及体形消瘦等典型的“三多一少”症状,垫料湿臭,成模小鼠体质量下降较快。小鼠灌胃给药后,各组小鼠一般状况比较,二甲双胍组、杨桃根多糖大剂量组较其他组小鼠状态有较明显改善,死亡率低,体质量增长速度与模型对照组小鼠相比差异有统计学意义(P<0.05)。各组小鼠体质量见表1。

2.2 6组小鼠的脾脏指数、胸腺指数

模型对照组小鼠的胸腺、脾脏与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),说明DM小鼠胸腺器官和脾脏萎缩,从而导致免疫能力下降。给药后,杨桃根多糖大剂量组与模型对照组小鼠的胸腺指数比较差异有统计学意义(P<0.01),说明杨桃根多糖可促进DM小鼠的胸腺增长;杨桃根多糖的大剂量组与模型对照组小鼠的脾脏指数比较差异有统计学意义(P<0.01),提示杨桃根多糖能提高DM小鼠的免疫力。结果见表2。

组别	初始体质量	第7天体质量	第14天体质量
正常对照组	21.0±0.85	24.67±1.05	28.08±1.05
模型对照组	22.74±2.58	20.69±2.71^*1	17.16±1.96
二甲双胍组	20.37±3.42	22.16±3.81	21.06±4.64^*2
杨桃根多糖
大剂量组	21.58±3.43	23.80±3.59^*2	21.92±4.98^*2
中剂量组	20.26±2.09	19.65±2.61	19.41±3.52
小剂量组	21.26±1.99	20.58±3.60	19.41±3.52

表1 6组小鼠的体质量变化g,x̅±s, n=10

组别	胸腺质量/mg	胸腺指数/(mg·g^-1)	脾脏质量/mg	脾脏指数/(mg·g^-1)
正常对照组	0.05±0.02	1.88±0.71	0.11±0.01	4.11±0.33
模型对照组	0.03±0.01^*1	1.98±0.51	0.03±0.01^*1	1.76±0.47
二甲双胍组	0.07±0.04	3.58±2.35	0.06±0.01	2.69±0.64
杨桃根多糖
大剂量组	0.08±0.02	3.57±0.53^*2	0.09±0.02	4.05±1.06^*2
中剂量组	0.01±0.01	0.51±0.26	0.05±0.03	2.39±1.18
小剂量组	0.02±0.01	1.08±0.47	0.05±0.02	2.81±1.11

表2 6组小鼠的胸腺、脾脏及其指数比较x̅±s,n=10

2.3 6组小鼠糖耐量实验结果

各组小鼠在灌葡萄糖溶液后0.5 h,血糖迅速升高,正常对照组小鼠血糖与模型对照组小鼠相比差异有统计学意义(P<0.01)。

杨桃根多糖各剂量组小鼠血糖水平在1,2 h时均比灌葡萄糖前高,与同期模型对照组比较,大剂量组抑制血糖升高作用更明显(P<0.01)。正常对照组小鼠2 h基本能恢复到灌葡萄糖前血糖水平。说明杨桃根多糖对DM小鼠葡萄糖耐受能力具有一定增强作用,能够较快抑制小鼠餐后血糖升高^[8],从而改善DM小鼠高血糖状态。

各给药组小鼠血糖曲线下面积(GAUC)与模型对照组小鼠比较差异有统计学意义(P<0.01)。提示杨桃根多糖可以改善DM小鼠对葡萄糖的耐受能力,结果见表3。

组别	0 h血糖	0.5 h血糖	1 h血糖	2 h血糖	GAUC
正常对照组	5.04±0.49	14.54±0.54	8.42±0.73	5.12±1.07	29.92±1.14
模型对照组	17.06±0.78^*1	30.89±1.92^*1	23.77±1.33^*1	20.28±0.87^*1	95.35±2.41^*1
二甲双胍组	12.46±0.78^*2	24.12±0.99^*2	20.22±0.95^*2	16.02±0.52^*2	76.69±2.21^*2
杨桃根多糖
大剂量	12.78±0.66^*2	22.37±1.57^*2	19.24±0.98^*2	15.24±0.60^*2	88.13±1.44^*2
中剂量	16.53±0.87	26.26±0.73^*2	22.77±0.92	19.93±1.68	88.62±2.49^*2
小剂量	16.91±0.76	26.63±1.27^*2	23.50±1.36	20.06±0.72	91.49±2.64^*2

表3 6组小鼠糖耐量比较mmol·L^-1,x̅±s,n=10

2.4 6组小鼠空腹血糖比较

给药前,模型对照组小鼠FBG与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。给药后,杨桃根多糖大剂量组与模型对照组相比,FBG明显降低(P<0.01),说明杨桃根多糖有显著的降糖效果,且降糖作用与给药剂量有一定关系,结果见表4。

组别	初始血糖	第7天血糖	第14天血糖	降糖率/%
正常对照组	5.02±0.19	4.97±0.42	4.96±0.33	-
模型对照组	20.61±1.10^*1	20.97±0.94^*1	17.89±0.66^*1	-
二甲双胍组	20.73±1.66	16.97±1.03^*2	13.35±0.70^*2	35.62
杨桃根多糖
大剂量组	21.07±1.72	17.07±0.91^*2	13.71±1.09^*2	31.99
中剂量组	20.85±1.30	20.42±0.56	17.21±1.95	17.46
小剂量组	20.95±0.92	20.30±0.88	17.45±1.92	16.71

表4 6组小鼠空腹血糖值比较mmol·L^-1,x̅±s,n=10

2.5 各给药组对糖尿病小鼠空腹血脂的影响

与正常对照组比较,模型对照组TG、TC、LDL-C明显升高,HDL-C明显降低;与模型对照组比较,各给药组TG、TC、LDL-C均有一定降低,二甲双胍组和杨桃根多糖大、中剂量组均差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结果见表5。

组别	HDL-C	LDL-C	TC	TG
正常对照组	1.01±0.13	0.51±0.03	0.77±0.12	1.35±0.24
模型对照组	0.66±0.09^*1	1.17±0.16^*1	2.12±0.32^*1	2.09±0.45^*1
二甲双胍组	0.80±0.12^*2	0.67±0.11^*2	1.43±0.17^*2	1.39±0.24^*2
杨桃根多糖
大剂量组	0.74±0.07^*3	0.71±0.14^*2	1.65±0.32^*2	1.58±0.29^*2
中剂量组	0.69±0.08	0.93±0.21^*2	1.78±0.37^*3	1.63±0.38^*3
小剂量组	0.66±0.96	0.98±0.25	1.81±0.37	1.77±0.56

表5 6组小鼠空腹血脂比较mmol·L^-1,x̅±s,n=10

3 讨论

DM是一种严重影响人类健康的疾病,近年来发病率呈上升趋势,受到世界各国政府和世界卫生组织的高度重视,用于该项研究的科研经费也逐年的增长。我国传统医药在治疗DM方面有独到之处,有着广阔的发展前景,受到国内外学者的广泛关注^[8-9]。

本实验通过对各组小鼠胸腺指数及脾脏指数的测定、分析,结果DM模型小鼠的胸腺指数和脾脏指数较正常对照组小鼠显著下降,说明DM模型小鼠免疫力明显下降。各给药组对STZ所致DM小鼠的胸腺和脾脏功能有一定的改善作用,可以提高DM小鼠的免疫功能。通过对各组小鼠糖耐量的测定发现各给药组对DM小鼠的葡萄糖耐受能力具有一定的增强作用,能够较好地抑制餐后小鼠血糖的迅速上升,改善DM小鼠餐后血糖过高的状况^[10]。通过对空腹血糖的测定发现治疗组对DM小鼠有一定的降糖作用。

实验观察发现,小鼠腹腔注射STZ后,与正常对照组比较,小鼠血清TG、TC、LDL-C含量明显升高,通过给药治疗后,与模型对照组比较,治疗组 TG、TC、LDL-C含量明显降低,HDL-C含量明显升高,提示杨桃根多糖可能通过抗氧化作用和增强免疫功能从而调节DM小鼠的血脂,改善STZ所致DM小鼠的血脂代谢紊乱。

The authors have declared that no competing interests exist.

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