傅立叶近红外漫反射光谱仪(德国,Bruker,MPA),紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司,TU-1810 DSPC型),数显水浴锅(金坛市富华仪器有限公司,HH-4),粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司,FW80型)。

平贝母(Fritillaria ussuriensis Maxim)样品(鳞茎)共80份。95%乙醇、浓硫酸(北京化工厂),香兰素(中国医药集团上海化学试剂公司)。

平贝母样品洗净,40 ℃烘干,粉碎后过孔径0.250 mm(60目)筛。精密称取定量的样品粉末,浸润12 h,加热回流提取,提取条件:提取溶剂70%乙醇,料液比1:5,1:2,热回流提取4 h,提取3次,3次滤液分别保存,作为供试溶液备用。

共采集2次光谱,分别为样品粉末的近红外光谱、提取液液体光纤近红外光谱(3次提取液分别采集)。

2.2.1 样品粉末近红外光谱采集 将“2.1”项中得到的样品粉末加入样品杯(样品杯容积的3/4),将样品杯放入旋转台,通过积分球来采集光谱。光谱采集条件:分辨率为8 cm^-1,样品扫描次数为64次,保存数据12 500~4 000 cm^-1,结果谱图为吸光度,保存的数据块为吸光度、单通道光谱、背景等。

2.2.2 提取液液体光纤近红外光谱采集 将光纤探头浸入提取液中,探头与液面成45°角,进行样品光谱采集。光谱采集条件:分辨率为8 cm^-1,样品扫描次数为32次,保存数据12 500~4 000 cm^-1,结果谱图为吸光度,保存的数据块为吸光度、单通道光谱、背景等。

样品含量检测指标主要有总生物碱的含量,采用UV法测定(参照2010年版《中华人民共和国药典》)。提取液总生物碱含量为实测值,样品粉末总生物碱含量为3次提取液总生物碱含量之和。

2.4.1 定量分析模型的建立 采用OPUS Version 6.5版软件中定量分析方法建立检测模型。将采集到的光谱和总生物碱化学值导入分析软件,并全部定义为校正集样品。采用偏最小二乘回归法(PLS)结合最小最大归一化和消除常数偏移量数据预处理方法,建立原材料、提取液校正模型,并通过交叉检验进行模型的验证。根据决定系数(R²)、交叉检验均方差(RMSECV)、相对分析误差(RPD)等参数对模型进行分析评价。

2.4.2 定量分析模型的检验 按照“2.2”项中方法采集原材料和提取液各3个未知样品的光谱图,利用建立的定量分析模型对未知样品的总生物碱含量进行预测分析;按照“2.1”项中方法对未知样品进行总生物碱含量分析,对预测值和化学参考值进行显著性分析(t检验)。

平贝母总生物碱含量与生长时间、产地等因素相关,本实验采集样品均来自我国平贝母主产区不同地点,生长时间为目前平贝母做货的常用年限;提取工艺为平贝母提取物常用工艺。因此,所选平贝母原材料、提取液样品具有代表性,其总生物碱含量范围分别为0.009 95~0.157,0.041 78~0.081 52 mg·mL^-1,平均值分别为0.083 48,0.061 65 mg·mL^-1。

80份平贝母原材料及提取液近红外光谱曲线区域在12 500~4 000 cm^-1波长范围下的光谱变化趋势见图1,2。可见,样品光谱曲线趋势类似,并没有明显的异常样品。

利用OPUS Version 6.5版软件建立检测模型。软件对光谱散射处理、数学处理、回归方法等影响模型结果的条件进行考察。考察的主要参数为:R²(决定系数)、RMSECV(交叉检验均方差)、RPD(相对分析误差)。决定系数R²是化学参考值中出现的变量的百分数,预测含量值愈接近化学参考值,R²愈接近100%;RMSECV表示的是交叉检验均方差,其值越小说明方法质量越高。通过光谱预处理、谱曲选择后建立的原材料定量分析方法和提取液定量分析方法R²都>0.90,原材料、提取液的RMSECV值分别为0.038 3,0.010(表1),模型的预测值与化学参考值之间存在较好的线性关系(图3)。

对光谱进行数学处理后,分别采用主成分分析法(PCA)、偏最小二乘法(PLS)、改进偏最小二乘法(MPLS),对校正集平贝母样品中各生物碱含量与近红外光谱数据进行回归,比较分析结果选取最优的回归方法。结果表明,采用偏最小二乘法(PLS)建立的定标方程模型的预测准确性最好。

利用模型对未知样品进行总生物碱含量预测,将预测结果与化学参考值进行显著性分析(t测验),其中原材料、提取液未知样品∣t∣均<t_0.05,P>0.05(表2),即原材料、提取液未知样品预测结果与化学参考值在0.05水平上差异无统计学意义,模型可用于对未知样品的总生物碱含量预测。