目的 探讨姜黄挥发油对HL-60细胞增殖抑制有效成分的提取分离与增殖抑制作用。方法 正己烷超声萃取姜黄挥发油部位成分,硅胶柱层析法及制备液相法分离纯化,磁共振法和质谱法鉴定化合物结构,噻唑蓝(MMT )法测定该化合物的HL-60细胞增殖抑制活性。结果 从姜黄挥发油中分离纯化并制备得到抗肿瘤活性较强的一个化合物,根据理化性质和波谱质谱数据分析鉴定其为芳姜黄酮,具有明显的HL-60细胞毒性,其不同时间(12,24,48 h)刺激HL-60细胞的IC50值分别为37.25,13.84,13.38 μg·mL-1,并且有显著的时间、浓度依赖性。结论 芳姜黄酮对HL-60细胞具有明显的增殖抑制活性。
姜黄为姜科植物姜黄(
芳姜黄酮对照品(印度NATURAL REMEDIES PRIVATE LIMITED,LOT NO:T13L094);正己烷(分析纯,天津市致远化学试剂有限公司,批号:20130701);甲醇(分析纯,天津市致远化学试剂有限公司,批号:20130613);乙酸乙酯(分析纯,天津市致远化学试剂有限公司,批号:20130507);高效液相(HPLC)甲醇(色谱纯,美国Fisher LOT140939);制备甲醇(色谱纯,上海星可高纯溶剂有限公司,批号:021450402);水(HPLC级超纯水);柱层层析硅胶200-300目(上海盛亚化工有限公司);人急性早幼粒白血病HL-60细胞(内蒙古国际蒙医医院蒙药实验室特格希老师惠赠);RPMI 1640 培养液(Hyclone 公司);胎牛血清(Gibco公司);青链霉素混合液(100×)Solarbio公司;MTT试剂盒(碧云天生物技术公司);Trizol(Invitrogen公司)。姜黄(产地四川,安徽博腾中药饮片有限公司,批号:130418),经内蒙古自治区国际蒙医医院国家蒙药制剂中心主任额尔德尼教授鉴定为姜科植物姜黄(
UltiMate3000高效液相色谱仪(美国Thermo公司);GELAI制备液相仪(成都格莱精密仪器有限公司);ZORBAX Extend-C18分析色谱柱(美国Agilent公司);ID25.4 mm×450 mm C18反相制备色谱柱(成都格莱Fuji公司);Bruker AVANCEIII500M磁共振仪(布鲁克公司);LCQ Advantage MAX质谱仪(美国Finigan公司);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHB-1循环水式真空泵(河南予华仪器有限公司);A10超纯制水机(Milli-Q公司);BSA224S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);KQ-500DE超声仪(昆山市超声仪器有限公司);SW-CJ-1D净化工作台(苏州净化仪器有限公司);Nikon ECLIPSE Ti显微镜;M200PRO全自动酶标仪(TECAN公司);NTT2200恒温水槽(上海爱朗仪器有限公司)311型二氧化碳培养箱(美国Thermo);BCD-398WT-J冰箱(海信电器);902型-80 ℃冰箱(美国Thermo);自动细胞计数器(Millipore公司);凝胶成像分析系统及紫外交联仪ZP-208(上海嘉鹏科技有限公司);多功能水平电泳槽(日本Mupid-2plus);超微量分光光度计(MYSPEC公司);2720热循环仪(Applied Biosystem公司)。
取姜黄药材500 g,粉碎后3倍量正己烷浸泡48 h并超声萃取40 min,提取液过滤,减压浓缩后得浸膏23 g。取浸膏1 g,用硅胶柱层层析梯度洗脱分离,洗脱液依次为正己烷→正己烷:乙酸乙酯 8:2→正己烷:乙酸乙酯 5:5→乙酸乙酯→甲醇,将这5个部位洗脱液样品减压浓缩,分别得0.082,0.768,0.081,0.024,0.016 g,并检测这5个部位样品的HL-60细胞增殖抑制活性。
姜黄正己烷提取物硅胶柱层层析梯度洗脱的8:2部位的收量最多,活性最强,结果见
化合物D 淡黄色油状物(甲醇)。ESI-MS
用不同浓度芳姜黄酮,依次以18.75,37.5,75,150,300,600 μg·mL-1刺激HL-60细胞,测定了芳姜黄酮对HL-60细胞12 ,24 ,48 h的毒性作用,得到芳姜黄酮作用于HL-60细胞的IC50和细胞毒性作用曲线,结果见
笔者在本实验以蒙医药传统理论及蒙医临床为指导,应用现代相关提取分离技术方法和同步抗肿瘤活性追踪筛选法对姜黄正己烷提取挥发油部分进行了分离纯化和制备,并鉴定出了对人急性早幼粒白细胞HL-60增殖抑制活性较强的化合物——芳姜黄酮,其IC50值为13.18 μg·mL-1,根据NCI(national cancer institute)标准:化合物IC50值 <30 μg·mL-1被认为具有药物活性,可作为抗肿瘤药物,先导化合物深度研究与开发。MTT实验结果表明芳姜黄酮有明显的肿瘤细胞毒性,为深入探索姜黄挥发油的抗肿瘤作用提供了实验依据,同时为寻找高效低毒的天然抗肿瘤药物开辟新的途径。
The authors have declared that no competing interests exist.