目的 建立淋巴方颗粒的质量标准。方法 采用薄层色谱法对淋巴颗粒中的苦参、玄参进行定性鉴别;采用高效液相色谱法测定淋巴方颗粒成品中苦参碱含量。结果 苦参碱在0.05~2.00 μg范围内,苦参碱的含量与峰面积呈现良好的线性关系,平均回收率为98.73%,RSD=2.2%。结论 该检测方法专属性好,灵敏,准确,可用于该制剂的质量控制。
Agilent1260系列液相色谱仪(G1311C四元泵,G1129B自动进样器,G1314B紫外检测器,Chemstation色谱工作站);Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm), BS110S电子天平(赛多利斯);CQ-25-6超声波发生器(上海音波声电科技公司,功率200 W,频率25 kHz;硅胶G薄层板(青岛海洋)。
淋巴方颗粒(Q1310003,Q1310004,Q1310005,自制),对照品:玄参对照药材(批号:121008-201308)、哈巴俄苷对照品(批号:111730-201307)、苦参碱对照品(批号:110805-200508)购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇均为色谱纯,水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯。
2.1.1 玄参的薄层鉴别 取本品2 g,碾为粉末后,加甲醇25 mL,浸泡1 h,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水25 mL使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次30 mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇5 mL使溶解,作为供试品溶液。另取玄参对照药材2 g,同法制成对照药材溶液。再取哈巴俄苷对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)实验,吸取上述3种溶液各4 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(12:4:1)的下层溶液为展开剂,置用展开剂预饱和15 min的展开缸内,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。见
2.1.2 苦参的薄层鉴别 取本品0.5 g,碾为粉末后,加浓氨试液0.3 mL,三氯甲烷25 mL,放置过夜,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷0.5 mL使溶解,作为供试品溶液。另取苦参碱对照品,加乙醇制成每毫升含0.2 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)实验,吸取上述两种溶液各4 μL,分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以甲苯-丙酮-甲醇(8:3:0.5)为展开剂,展开,展距8 cm,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液,加热至斑点显示清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的橙色斑点。见
2.2.1 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱采用Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以磷酸盐缓冲溶液-乙腈-甲醇(70:15:15)为流动相;流速1.0 mL·min-1,检测波长为220 nm。此条件下,阴性对照品对样品测定无干扰,方法专属性良好。
2.2.2 对照品溶液的制备 取苦参碱对照品适量,精密称定,加甲醇溶解制成每毫升含苦参碱50 μg的溶液,即得。
2.2.3 供试品溶液和阴性对照品溶液的制备 取本品粉末约0.12 g,置具塞锥形瓶中,加入浓氨试液0.5 mL,精密加入三氯甲烷20 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率250 W,频率33 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用三氯甲烷补足减失的质量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 mL,加在中性氧化铝柱(100~200目,5 g,内径1 cm)上,依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇(7:3)混合溶液各20 mL洗脱,合并收集洗脱液,回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。另取不含苦参的阴性样品,按上述同样方法操作,制成阴性对照品溶液。
2.2.4 测定法 分别精密吸取上述3种溶液各10 μL,注入液相色谱仪,按照“2.2.1”项下色谱条件测定。
2.2.5 线性关系考察 配制浓度分别为5.00,25.0,50.0,100,200 μg·mL-1的对照品溶液,在上述色谱条件下,各进样10 μL,测定峰面积(
2.2.6 精密度实验与稳定性实验 ①日内精密度:精密吸取对照品溶液10 μL,按上述液相色谱法测定其峰面积,连续测定6次,计算得到RSD=1.53%(
2.2.7 加样回收率实验 精密吸取已知含量的供试品溶液200 μL,分别精密加入浓度为50 μg·mL-1的苦参碱对照品溶液80,100,120 μL,充分混匀后,在上述色谱条件下测定其含量,计算加样回收率,每一浓度平行操作3次。结果表明平均回收率为98.73%,RSD=2.2%(
2.2.8 样品的含量测定 分别取批号为Q13100003,Q13100004 ,Q13100005的淋巴方颗粒,制备样品溶液,按照“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积,外标法计算样本中苦参碱的含量。结果3个批号苦参碱含量分别为2.43%,2.01%,5.90%。
笔者在做淋巴方颗粒质量标准研究时,曾按照《中华人民共和国药典》2010年版丹参的薄层鉴别方法,对颗粒中丹参进行鉴别研究,对照品采用丹参酚酸B,但样品组和丹参阴性组在色谱相应的位置上均无丹参酚酸B斑点,这可能与淋巴颗粒制备时提取过程中丹酚酸B与苦参碱或氧化苦参碱发生反应有关,故丹参的薄层鉴定方法不作为本品鉴别方法。
淋巴方颗粒选取苦参碱作为控制本品质量的指标成分,用高效液相色谱法进行测定,笔者按照《中华人民共和国药典》2010年版一部苦参药材项下含量测定方法测定时,重复性差,专属性不强,故在此基础上,进行调整,改用本文方法后,重复性好,专属性强。
The authors have declared that no competing interests exist.