目的 建立反相高效液相色谱(HPLC)法测定乳癖胶囊中阿魏酸含量。方法 色谱柱为Agilent HC-C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为甲醇-1%醋酸溶液(27:73),流速为1.0 mL·min-1,检测波长为321 nm,进样体积20 μL。结果 阿魏酸的进样量在0.272 4~0.681 0 μg范围内与峰面积线性关系良好(
乳癖胶囊系解放军第四十二医院传统配方,经过数十年的临床验证,疗效确切,一直沿用至今。其方由黄芪、当归、柴胡、香附等34味中药组成,具有理气活血、清热解毒、疏肝解郁、化痰散结之功效,主治乳腺增生、乳腺纤维瘤、乳腺纤维囊性病[1]。乳癖胶囊中的主药当归为伞形科植物当归[
安捷伦Agilent 1100高效液相色谱仪;KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸易有限公司);DK-S26恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);BT25S电子分析天平(德国赛多利斯,感量:0.01 mg);BSA2245电子天平(德国赛多利斯,感量:0.1 mg)。
乳癖胶囊[解放军第四十二医院药剂科制剂室自制,批准文号:成制字(2011)F11001,规格:每粒0.35 g];阿魏酸对照品(纯度:99.6%,中国食品药品检定研究院,批号:110773-201313);甲醇(Fisher Scientific,色谱纯);超纯水(自制),其他试剂为分析纯。
色谱柱:Agilent HC-C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm) ,以甲醇-1%醋酸溶液(27:73)为流动相;流速为1 mL·min-1,柱温:室温,检测波长为321 nm,进样量:20 μL。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4 000。
精密称取阿魏酸对照品14.25 mg,置25 mL棕色量瓶中,加70%甲醇溶解稀释,定容摇匀后作为储备液。再精密量取储备液1 mL,置25 mL棕色量瓶中,加70%甲醇溶解稀释,定容摇匀制得每毫升含22.8 μg的对照品溶液。
取本品内容物约5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇20 mL,密塞,称定质量,加热回流30 min,放冷,再称定质量,用70%甲醇补足减失的质量,摇匀,静置,取上清液,滤过,取续滤液,用微孔滤膜(孔径0.45 μm)过滤,即得。
按处方比例,取除当归外药材,按规定工艺制备不含当归的阴性样品,按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。按上述色谱条件进样分析,供试品溶液在与阿魏酸对照品溶液相应保留时间处有相同色谱峰出现,且主峰与相邻色谱峰能完全分开,峰形良好,在与阿魏酸峰相应的位置上,阴性对照无干扰。由于实验条件所限,无柱温箱,供试品溶液和对照品溶液中阿魏酸峰的保留时间略有差别。见
精密吸取同一对照品溶液20 μL,按上述色谱条件连续重复进样5次,依法测定阿魏酸含量,RSD为1.60%(
取供试品溶液,分别在0,0.5,2,5,8,12,24 h进样,测定峰面积RSD=1.40%,表明供试品溶液在24 h内稳定。
取对照品溶液(22.8 μg·mL-1),通过系统自动进样器,分别进样12,16,20,25,30 μL,以对照品进样量为横坐标(
取同一批乳癖胶囊样品,按供试品制备方法平行处理6份样品,测定峰面积,以峰面积/称样量的比值计算RSD=0.48%(
采用加样回收法,精密称取已知含量的供试品6份(阿魏酸含量为68.5921 μg·g-1),用100~1 000 μL移液枪精密加入阿魏酸储备液(567.72 μg·mL-1)320 μL,按“2.3”项方法制备供试品溶液,精密吸取20 μL,按色谱条件进样,测得平均回收率为100.30%,RSD=1.12%(
取供试品3批次,按“2.3”项制备供试品溶液,按上述色谱条件进样分析,记录峰面积,采用外标法计算阿魏酸的平均含量,结果批号为20150201,20150204,20150212样品,每粒含阿魏酸分别为24.039,24.017,23.958 μg,平均为24.005 μg。
选用70%甲醇、70%乙醇作为提取溶剂进行了比较,提取方法及含量测定方法相同,但70%甲醇作为提取溶剂测得含量较高,因此选择70%甲醇作为提取溶剂。
以70%甲醇作为提取溶剂,提取方法分别采用超声提取30 min,加热回流提取30,60 min;测定方法相同,加热回流提取30,60 min含量相当,且测得含量较超声提取30 min高,因此选择加热回流提取30 min作为提取方法。
在阿魏酸测定的HPLC方法学考察中,选择的甲醇-1%醋酸溶液(27:73)流动相系统能使乳癖胶囊中当归的阿魏酸得到良好的分离,阴性无干扰。通过调整甲醇和1%醋酸溶液的比例(21:79,24:76,27:73),经比较发现,甲醇-1%醋酸溶液(27:73)作为流动相时供试品色谱分离最好,保留时间适宜。
The authors have declared that no competing interests exist.