目的 建立复方鱼腥草合剂中连翘苷含量的测定方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为Agilent SB-Phenyl(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈—0.5%醋酸进行梯度洗脱,检测波长277 nm,流速1.5 mL·min-1,柱温为40 ℃。结果 连翘苷在9.09~181.74 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系,平均回收率96.31%,RSD=0.98%(
复方鱼腥草合剂为鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘、金银花经提取精制而成的中成药制剂,其功能主治为清热解毒。用于外感风热引起的咽喉疼痛、急性咽炎、扁桃体炎有风热证候者 [1]。其中黄芩苷、连翘苷为其主要活性成分,目前,复方鱼腥草合剂的质量标准收载于《国家中成药标准汇编内科肺系(一)分册》和《新药转正标准73册》中,但这两个法定标准只对黄芩苷含量进行控制。现阶段对于复方鱼腥草合剂中连翘苷含量测定的报道很少,笔者采用高效液相色谱法测定复方鱼腥草合剂中连翘苷的含量,方法稳定可靠,专属性强,可用于该制剂的质量控制。
Agilent1260 高效液相色谱仪(G1311C型混合泵,G1329B型进样器,G1316A型柱温箱,G4212B型DAD检测器),Agilent SB-Phenyl(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,连翘苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110821-201213,含量:95.3%),水(纯化水),乙腈(Merck,色谱纯),其他试剂均为分析纯。复方鱼腥草合剂(浙江康恩贝中药公司,批号:140305,140306,140307)。
色谱柱为Agilent SB-Phenyl(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相A为乙腈,流动相B为0.5%醋酸,按照
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取连翘苷对照品19.07 mg,置于100 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,得浓度为0.181 7 mg· mL-1连翘苷对照品贮备液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密吸取供试品25.0 mL,用水饱和正丁醇分3次振摇提取,每次25 mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加中性氧化铝2.5 g,少量甲醇拌匀,挥干,加在中性氧化铝柱(100~200目,2 g,内径为1.5~1.8 cm)上,用70%乙醇80 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加50%甲醇使溶解,转移至10 mL量瓶,加50%甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
按处方工艺制备不含连翘的阴性样品,按“2.2”项方法制备阴性供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进行测定,记录色谱图,见
分别精密吸取“2.2.1”中连翘苷对照品贮备液0.5,1,2,4,6,8 mL置10 mL量瓶,加甲醇至刻度,摇匀,即得。分别精密吸取上述溶液及连翘苷对照品贮备液各20 μL,注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件进行测定,记录峰面积,以连翘苷峰面积与进样浓度作线性回归处理,回归方程为:
取复方鱼腥草合剂(批号:140306),按照“2.2.2”项供试品溶液制备方法操作,制备供试品溶液,重复进样6次,按“2.1”项色谱条件进行测定,记录连翘苷的峰面积,结果RSD=0.5%(
取复方鱼腥草合剂(批号:140306),按“2.2.2”项供试品溶液制备方法操作,制备供试品溶液,0,2,4,8,12,24 h分别进样,按“2.1”项色谱条件进行测定,记录峰面积,结果RSD=0.3%(
取复方鱼腥草合剂(批号:140306),按“2.2.2”项供试品溶液制备方法操作,制备供试品溶液6份,按“2.1”项色谱条件进行测定,结果连翘苷平均含量为15.4 μg· mL-1,RSD=1.2%(
精密吸取已知含量的复方鱼腥草合剂(批号:140306)12.5 mL,精密加入一定量的连翘苷对照品,加水12.5 mL,摇匀,按照“2.2.2”项方法制备供试品,按“2.1”项色谱条件进行测定,并计算回收率,结果平均回收率为96.31%,RSD=0.98%(
取3批复方鱼腥草合剂样品,按“2.2.2”项方法制备供试品溶液,分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μL,按“2.1”项色谱条件进行含量测定,记录峰面积,计算含量,结果批号为140305,140306,140307的样品,连翘苷含量分别为14.6,15.4,16.5 μg· mL-1(
检测波长选择:取每毫升含连翘苷70 μg的对照品溶液,按上述色谱条件进样检测,用DAD在200~600 nm处扫描,记录光谱数据,连翘苷在277 nm波长处有最大吸收,故选择277 nm为测定波长。
供试品溶液制备中,分别以石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇为萃取溶剂振摇提取,结果水饱和正丁醇提取样品中连翘苷含量明显高于其他溶剂提取,因此确定水饱和正丁醇为提取溶剂。分别振摇提取提取1,2,3,4次,结果表明提取3及4次者无显著差异,选择振摇提取3次即可。参考《中华人民共和国药典》2010年版连翘[含量测定]项方法,使用中性氧化铝可以很好的除去黄酮类化合物等杂质的干扰。
以不同比例乙腈-水、乙腈-冰醋酸、甲醇-水为流动相进行试验,结果流动相为乙腈-0.5%醋酸(18.5:81.5)时,连翘苷分离度高,稳定性较好。
结果显示,康恩贝中药有限公司提供连续生产3批复方鱼腥草合剂中连翘苷含量基本稳定。
The authors have declared that no competing interests exist.