目的 观察外用莪术油乳膏对乳腺增生模型大鼠的影响,并探讨其作用机制。方法 将60只雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、散结乳癖贴膏组和莪术油乳膏大、中、小剂量组,每组10只。采用大鼠后腿内侧肌内注射苯甲酸雌二醇联合黄体酮法复制乳腺增生模型,给予不同剂量药物干预,连续4周。酶联免疫吸附法、苏木精-伊红(HE)染色法和免疫组化法探讨外用莪术油对乳腺增生的作用机制。结果 莪术油乳膏对乳腺增生有一定防治作用。与模型对照组比较,莪术油大剂量组大鼠乳房直径显著缩小( P<0.01),体质量恢复正常,血清雌二醇( P<0.01)、促卵泡激素( P<0.05)、泌乳素( P<0.01) 均明显降低,孕酮、睾酮、促黄体生成素含量升高( P<0.01),小叶内腺泡数量及直径显著减少。结论 莪术油乳膏能显著改善大鼠血清激素水平紊乱,抑制乳腺增生发生。
Objective To observe the effect of external use of Curcuma oil on the hyperplasia of mammary glands in rats and explore the mechanism.Methods Sixty female Wistar rats were randomly divided into following groups: normal control group, model control group, Sanjierubi plaster group, low-, medium- and high-dose curcuma oil emulsion groups (n=10 each).The models of hyperplasia of mammary glands were established by intramuscular injection of estradiol benzoate and progesterone into the medial part of the rat hind limb.Different doses of medicines were given for 4 consecutive weeks.Enzyme-linked immunosorbent assay, HE staining and immunohistochemistry were used to investigate the action mechanism of curcuma oil emulsion against mammary gland hyperplasia.Results Curcuma oil emulsion had preventive and therapeutic effects on the hyperplasia of mammary glands.The diameter of breasts was significantly reduced, the body weight restored, serum estradiol, follicle-stimulating hormone and prolactin levels profoundly decreased, progesterone, testosterone and luteinizing hormone levels markedly increased and the number and diameter of lobular acini obviously reduced in high-dose curcuma oil emulsion group when compared with those in model control group (P<0.05 or P<0.01).Conclusion Curcuma oil emulsion can remarkably improve the disturbance of serum hormones and inhibit the occurrence of hyperplasia of mammary glands.
乳腺增生症又称乳腺结构不良、纤维囊性乳腺病,是临床常见乳腺疾病[1,2,3]。近年来,乳腺增生发病率逐渐增高,并向低龄化发展。目前临床常用治疗药物有抗雌激素类、雄激素类和降催乳激素类药物等,典型的药物为三苯氧胺、溴隐亭等[4,5]。但口服这些药物多只是缓解或改善症状,且副作用大,用之不当反而可致体内激素紊乱,很难使增生后的乳腺组织改变得到复原。透皮吸收制剂具有使用方便、无胃肠道刺激和肝脏首关效应、血药浓度平稳等特点[6,7]。乳腺增生病病变位置表浅,经皮给药为治疗该病的可参考给药途径,药物透皮吸收可通过乳房皮下、乳晕腺、毛囊、皮脂腺及汗腺淋巴管分布至腺叶间和小叶间等途径实现。莪术油制剂在治疗乳腺增生等疾病方面有显著疗效,笔者通过建立大鼠乳腺增生疾病模型,从血清激素指标、乳腺组织病理形态等探讨莪术油乳膏治疗乳腺增生的作用机制,以期为临床上开发治疗乳腺增生的新制剂提供科学依据。
苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批号:100526,规格:5 mg·mL-1),黄体酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批号:101207,浓度:20 mg·mL-1),散结乳癖贴膏(黑龙江鹤翔制药有限责任公司,批号:110225,每贴5 g),莪术油原料药(湖北巨胜科技有限公司,批号:20120429,含量:70%)。酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒(均为上海宝曼生物科技有限公司),即雌二醇(estradiol,E2,批号:20120311)、孕酮(progesterone,P,批号:20121023)、睾酮(testosterone,T,批号:20120503)、泌乳素(prolactin,PRL,批号:20120918)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH,批号:20121021)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH,批号:20120828)。聚赖氨酸玻片(福建迈新生物技术有限公司),大鼠孕激素受体(progesterone receptor,PR,批号:120929)、雌激素受体(estrogen receptor,ER,批号:121128)多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),脱毛膏(广州诺非化妆品有限公司,批号:20110429)。
TE2000倒置荧光显微镜照相系统(日本尼康公司)、NIS-Elements图像采集软件(日本尼康公司),Tecansafire2多功能酶标仪(奥地利Safire公司),RM2235石蜡切片机(德国Leica公司)。
雌性未孕SPF级Wistar大鼠,体质量180~200 g,8~10周龄,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物使用许可证编号:SCXK(京)2007-0001,合格证号:2010311。
将60只雌性大鼠随机分成6组:正常对照组,模型对照组,散结乳癖贴膏组,莪术油乳膏小、中、大剂量组(15,30,45 g·kg-1)。模型对照组给予苯甲酸雌二醇,0.5 mg·kg-1·d-1,大鼠后腿内侧肌内注射,连续23 d,然后连续注射黄体酮5 d,4 mg·kg-1·d-1,通过对比、观测大鼠乳腺特征,制造乳腺增生病模型;正常对照组给予0.9%氯化钠溶液0.1 mL ,时间同模型组[8]。
莪术油乳膏由莪术油、十六醇、白凡士林、单硬脂酸甘油酯、PEG-8蜂蜡、月桂醇硫酸钠、甘油与纯化水配制而成(齐齐哈尔医学院医药科学研究中心提供,批号:20130212),莪术油乳膏中莪术油含量0.014 mL·g-1,同时配制一份未加主药的空白基质制剂。造模同时莪术油乳膏大、中、小剂量组开始用棉球涂抹莪术油乳膏,每只0.4 g,散结乳癖贴膏组涂抹散结乳癖贴膏[9],模型对照组和正常对照组均给予等量未加药的空白基质制剂,每天1次,连续4周。
用游标卡尺精确测量大鼠第2,3对乳头直径,观察给药第1,2,3和4周(每周第7天同一时间测定)后大鼠乳头高度、直径变化。造模及给药同时监测1,2,3,4周后大鼠体质量变化。
末次给药后,各组大鼠进食供水12 h,摘除眼球取血,3 000 r·min-1离心5 min( r=10 cm),取血清。用ELISA试剂盒按酶联免疫吸附法测定血清E2、P、T、PRL、FSH、LH含量。
剖取各组大鼠乳腺组织,常规制片,苏木精-伊红(HE)染色后显微镜下观察各组大鼠乳腺组织形态学变化,包括腺泡数量及腺泡直径等。
采用SPSS 17.0版软件进行统计学分析,数据以均数±标准差(
与正常对照组大鼠比较,模型对照组大鼠造模4周后乳头直径明显增加( P<0.05),见表1。结果表明,模型对照组大鼠第2,3对乳头高度明显高于其他各组( P<0.01);除莪术油乳膏小剂量组外,模型对照组大鼠第二、三对乳头直径明显大于其他各组( P<0.05或 P<0.01),经药物干预后各组有所缩小。
![]() | 表1 6组大鼠乳头高度与直径比较 Tab.1 Comparison of the height and diameter of the nipples in six groups of rats mm, n=10, |
正常对照组大鼠饮水进食正常,体质量迅速增长;模型对照组大鼠未见死亡,均能正常饮水、进食,第2周内出现疾病模型;各用药组体质量增长幅度较正常对照组降低,第3周有所恢复,结果见表2。
![]() | 表2 6组大鼠体质量变化测定结果 Tab.2 Determination on body weight of six groups of rats g, n=10, |
与正常对照组比较,模型对照组E2、PRL、FSH显著升高,P、T、LH显著降低,呈内分泌紊乱状态。药物干预后,大鼠内分泌紊乱改善,E2、PRL、FSH水平降低,P、T、LH水平升高。莪术油乳膏小、中、大剂量组E2、P、PRL均不同程度改善,接近正常对照组,莪术油乳膏大剂量组优于散结乳癖贴膏组( P<0.05, P<0.01);莪术油乳膏小、中、大剂量组T、FSH、LH水平均不同程度改善,均接近正常对照组,结果见表3。
![]() | 表3 6组大鼠血清激素含量测定结果 Tab.3 Content determination of serum hormone in six groups of rats n=10, |
对采血后大鼠进行乳腺组织取材,HE染色结果见图1。正常对照组大鼠乳腺腺泡小叶状均匀分布,导管细长,分枝少,腺泡、导管均有两层细胞,内为腺上皮,单层立方状,排列整齐,外为胞浆空亮的肌上皮细胞,间质为脂肪组织及疏松结缔组织。模型对照组大鼠乳腺腺泡及导管增生,小叶内腺泡密集,大小不等,腺泡腔和导管扩张,腔内出现大量分泌物,导管分枝增多。药物干预后,模型大鼠乳腺腺泡恢复正常,分布均匀,腺上无分泌现象,大多数导管细长,分枝少,腔内残留少许分泌物,呈现良好的治疗效果。经统计软件测量分析,模型对照组较正常对照组乳腺腺泡数量增多,乳腺腺泡直径增大,各用药组乳腺腺泡数量减少,乳腺腺泡直径减小。结果见表4。
![]() | 表4 6组大鼠乳腺组织腺泡数量和腺泡平均直径比较 Tab.4 Comparison of the number and average diameter of mammary acini among six groups of rats n=10, |
本实验结果显示,莪术油制剂可显著调节血清性激素含量,明显改善乳腺增生模型大鼠病理形态,表明外用莪术油对乳腺增生病有一定防治作用。
笔者应用雌、孕激素造模,成功复制乳腺增生病大鼠模型,采用乳房局部给药干预,从组织病理学、血清学等角度验证莪术油乳膏干预大鼠乳腺增生大鼠的作用机制,证实莪术油外用能抑制乳腺增生的发生、发展。
本实验中莪术油乳膏通过透皮吸收,药物直达病灶,可不经过肝脏首关效应,亦不受消化液等影响,有利于药物的吸收和发挥疗效。文献[10-12]报道的治疗乳腺增生的中药制剂多由多味中药提取液制得,成分复杂,而本实验采用的莪术油以成分较明确的原料药入药,不仅能使有效成分直达病灶,而且增大载药量。
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