目的 建立高效液相色谱一测多评法,同时测定肾炎四味颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量。方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液,梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长为278 nm。以黄芩苷为参照,建立黄芩苷与其他3种成分相对校正因子,计算其他3种成分的含量,实现一测多评,同时利用外标法测定这4种成分的含量,比较两者的差异,验证一测多评法的准确性和科学性。结果 一测多评法的计算结果与外标法的实测值之间差异无统计学意义。结论 一测多评的质量评价模式用于肾炎四味颗粒的质量控制可行,且准确。
Objective To establish an HPLC method to measure four flavonoids (baicalin, wogonoside,baicalein and wogonin) in
当前中药质量控制模式已逐渐由单一成分控制转向多指标评价模式,但在实验过程中需要用足够的化学对照品。由于中药的化学对照品分离难度大、部分品种价格过高或稳定性差等因素,中药对照品的供应一直是困扰质量标准制定和执行的难题,一些进行多组分质量控制的标准甚至难以执行。因此,本项目旨在建立一测多评法对肾炎四味颗粒进行多指标质量控制研究,即以黄芩苷对照品为参照物,通过建立其与汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的相对校正因子(relative correction factor,RCF)进行含量计算,以降低检测成本和时间,并对方法的准确度和重复性进行验证。
Agilent 1100高效液相色谱仪; DIONEX ultima 3000高效液相色谱仪;Waters e2695-2489高效液相色谱仪;色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×150 mm,5 μm)、phenomenex Gemini C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、TechMate C18-ST (4.6 mm×150 mm,5 μm),CAPCELL PAK C18 MG (4.6 mm × 250 mm,5 μm),Welch Xtimate C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm),Waters SunFireTM C18(4.6 mm × 150 mm,5 μm);梅特勒-托利多MS204S/Z电子天平(感量0.1 mg);梅特勒-托利多MS105电子天平(感量0.01 mg);超声仪(济宁市中区鲁超仪器厂)。
黄芩苷(批号:110715-201318, 含量:93.3%)、黄芩素(批号:111595-201306, 含量:98.5%)、汉黄芩素对照品(批号:111514-201304, 含量:97.6%)均由中国食品药品检定研究院提供;汉黄芩苷对照品(成都曼思特生物科技有限公司,批号:MUST-0031201,含量>98.0%),甲醇(色谱纯,美国Fisher 公司,批号:20131215),磷酸(分析纯,北京化工厂,批号:20140126),乙醇(分析纯,北京化工厂,批号:20140315),色谱用水为Millipore制备超纯水;肾炎四味颗粒(规格:每袋5 g)8批,湖北科益药业股份有限公司生产。
Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱;流动相:甲醇(A)-0.4%磷酸(B),梯度洗脱(0~10 min,55%B;~30 min,55%→20% B);流速1.0 mL·min-1;柱温30 ℃;检测波长为278 nm;进样量10 μL。在上述色谱条件下,各组分理论板数均不低于4 000,样品中各待测组分与相邻峰分离度均>1.5,色谱图见
取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量加甲醇制成浓度分别为30.17,15.22,12.96,11.43 μg·mL-1的混合溶液,即得。
取本品30 g,混匀,取0.5 g,精密称定,置100 mL量瓶中,加70%乙醇约80 mL,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,加70%乙醇至刻度,摇匀,滤过。精密量取续滤液2 mL,置10 mL量瓶中,加70%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得。
按处方的组成,取除黄芩外其他药味,按工艺制法制成阴性样品,按供试品溶液制备方法制备,即得。
2.5.1 波长的选择及峰纯度检测 采用光电二极管阵列检测器,对供试品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素进行峰纯度检测,结果峰纯度均符合要求;根据对照品二极管阵列检测器扫描图,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素最大吸收波长分别为277.6,330.5,275.5,275.0 nm,综合考虑,选择检测波长为278 nm。
2.5.2 线性关系考察 取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品浓度分别为150.35,77.80,65.12,62.10 μg·mL-1的混合对照品溶液1.0,2.0,4.0,8.0,12.0,16.0,20.0 mL,分别置25 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,进样量均为10 μL,记录色谱图,以测得峰面积(
2.5.3 精密度实验 精密量取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素浓度分别为30.17,15.22,12.96,11.43 μg·mL-1的对照品混合溶液,连续进样6次,进样量均为10 μL,结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.93%,0.95%,1.24%和1.06%,表明仪器精密度良好。
2.5.4 稳定性实验 取同一份供试品溶液,分别在配制后0,2,4,8,24 h进样,进样量均为10 μL,结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.12%,0.88%,1.13%和1.17%。表明供试品溶液在24 h内稳定,能保证含量测定的时间要求。
2.5.5 重复性实验 取同一批号样品溶液6份,分别依法操作,测定4种成分含量。结果黄芩苷平均含量为37.1 mg·g -1,RSD=1.25%;汉黄芩苷平均含量为12.2 mg·g -1,RSD=1.19%;黄芩素平均含量为13.4 mg·g -1,RSD=1.28%;汉黄芩素平均含量为10.6 mg·g -1,RSD=1.11%。
2.5.6 加样回收率实验 取已知含量的样品9份,每份取样量约0.25 g,分别加入混合对照品溶液(含黄芩苷9.96 mg·mL-1,汉黄芩苷3.06 mg·mL-1,黄芩素3.34 mg·mL-1,汉黄芩素2.71 mg·mL-1)0.8,1.0,1.2 mL,按“2.3”项供试品溶液的制备方法操作,测定含量,结果见
取“2.5.2”项数据,以黄芩苷为参照物,按式(1)计算各成分RCF,结果见
式(1):
式中
在Agilent 1100、DIONEX ultima 3000、Waters e2695-2489 3种高效液相色谱仪上,分别考察本色谱条件在Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×150 mm,5 μm)、phenomenex Gemini C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、TechMate C18-ST (4.6 mm×150 mm,5 μm)、CAPCELL PAK C18 MG (4.6 mm×250 mm,5 μm)、Welch Xtimate C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters SunFireTM C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)6 种色谱柱上的RCF值,结果见
色谱峰准确定位是保证一测多评法应用的前提,一般采用的是保留时间差(ΔtRas)或相对保留值(Ras)等参数,因常规色谱柱长度有150与250 mm两种规格,保留时间差(ΔtRas)差别较大,因此本研究拟采用相对保留值(Ras)进行定位。分别考察了不同仪器、不同色谱柱上Ras的重复性,结果见
取样品8批,按“2.3”项方法制备供试品溶液,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液进样测定,采用外标法和一测多评法计算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量,结果见
肾炎四味颗粒及其系列制剂标准对黄芩的质量控制均体现为“黄芩苷”的含量。鉴于制定中药质量标准应以中医临床用药中注重整体的观念为基础,黄芩的抗炎作用是多种成分的综合作用,因此仅用某一种成分作为衡量该药味质量的指标,就不能体现其内在本质,所以建立多种有效成分或专属性成分的含量测定方法、探讨多成分综合评价体系是非常必要的。一测多评法的建立为其系列制剂质量标准的提高提供了思路和方法。
本方法采用Ras对色谱峰进行定位,因仪器设备及色谱柱的限制,仅考察3种高效液相色谱系统和6种不同品牌色谱柱。实验中如相对保留时间略超出规定范围时,可以结合色谱图整体特征及每个峰的紫外光谱特征来定位,或选用各对照品对色谱峰进行定位,确定目标峰位置[5]。
The authors have declared that no competing interests exist.