雄性SD大鼠,体质量200~220 g,由第四军医大学实验动物中心提供,动物合格证号:医动字第08-005号,实验动物生产许可证号:SCXK(军)2007-007。大鼠分笼喂养,室温(23±2)℃,相对湿度40%~60%,光照、黑暗12 h交替,自由获取标准饲料和饮水,实验前禁食12 h,不禁水。

高效液相色谱仪(安捷伦1200,VWD紫外检测器);高速冷冻离心机(Thermo Fisher公司);蠕动泵(河北保定兰格恒流泵有限公司,型号:BT100-1F);超纯水器(美国Millipore公司);恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司,型号:DK-98-11);CP225D电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司,感量:0.01 mg);超声波清洗器(浙江昆山禾创超声仪器有限公司,型号:KH 5200DV);涡旋振荡器(德国IKA公司)。盐酸异丙嗪(天津市希恩思生化科技有限公司,批号:P58421B2S,纯度:99%);苯巴比妥(江苏森萱医药化工有限公司,批号:744809,纯度:98%);酚红(天津市天新精细化工开发中心,批号:20131203,纯度:98%);甲醇,乙腈色谱级;其他试剂市售分析纯。Krebs-Ringer试剂,简称K-R液,称取氯化钠7.8 g,氯化钾0.35 g,碳酸氢钠1.37 g,磷酸二氢钠0.32 g,氯化镁0.02 g,葡萄糖1.4 g,加水定容至1 000 mL,即可得到pH值为7.4的K-R试液。

盐酸异丙嗪溶液的配制:精密称定盐酸异丙嗪10 mg,空白K-R液稀释成1 mg·L^-1作为储备液(将盐酸异丙嗪10 mg置于100 mL量瓶,空白K-R液定容至刻度)。酚红溶液的配制:精密称取酚红10 mg,用空白K-R液稀释成1 mg·L^-1作为储备液(将酚红10 mg置于100 mL量瓶,空白K-R液定容至刻度)。

Intersil^®ODS-3 C₁₈色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-磷酸二氢钾(0.02 mol·L^-1)=30:70;流速:1 mL·min^-1,检测波长:249 nm,柱温:30 ℃,进样量20 μL。色谱峰见图1。

比较空白K-R液,盐酸异丙嗪,酚红及样品中各自的色谱峰,发现没有内源性干扰。见图2。

①精密量取盐酸异丙嗪储备液适量,用空白K-R液稀释配制成异丙嗪浓度为200,100,50,10,5,1 μg·mL^-1系列浓度,12 000 r·min^-1离心10 min,取上清液,经孔径0.45 μm滤膜滤过,HPLC进样20 μL测定。以盐酸异丙嗪浓度为横坐标(X),盐酸异丙嗪峰面积为纵坐标(Y),线性方程:Y=94.599X-15.436,R²=0.999 1。结果表明盐酸异丙嗪在1~200 μg·mL^-1线性关系良好。②精密量取酚红储备液适量,用空白K-R液配制成酚红浓度为100,50,25,10,5,1 μg·mL^-1系列浓度,12 000 r·min^-1离心10 min,取上清液,经孔径0.45 μm滤膜滤过,HPLC进样20 μL测定。以酚红浓度为横坐标(X),酚红峰面积为纵坐标(Y),线性方程:Y=23.971X-0.864 1,R²=0.999 2,结果表明酚红在1~100 μg·mL^-1线性关系良好。

精密量取盐酸异丙嗪储备液适量,稀释为10,20,40 μg·mL^-1各6份,于同一日内测定6次和3 d内分别测定,按照上述样品处理办法,计算日内精密度和日间精密度。按照加入浓度和HPLC测定的浓度,进行峰面积比较,从而计算盐酸异丙嗪的回收率。实验结果表明,日内精密度和日间精密度RSD均<7.1%,提取回收率为(95.6±1.34)%。见表1。

精密量取盐酸异丙嗪储备液适量,稀释为10,20,40 μg·mL^-1各浓度6份,分别置于4 ℃,常温(25 ℃)与37 ℃水浴中,均在0,2,4,8,12,24 h取样进行检测含量,考察样品的稳定性。实验结果表明盐酸异丙嗪在4 ℃,常温与水浴37 ℃中,24 h内稳定性都较好,RSD均小于4%。见表2。

SD大鼠隔夜禁食(自由饮水),腹腔注射质量浓度10%苯巴比妥1 mL·(200 g)^-1麻醉,将大鼠固定在板子上面,四肢用橡皮筋固定,用剪刀从腹部打开腹腔,分离出小肠(十二指肠为距离幽门1 cm处开始,长10 cm;空肠为距离幽门15 cm处开始,长10 cm;回肠为距离盲肠以上20 cm处开始,往下10 cm;结肠段为盲肠往下1 cm开始,取10 cm。)在每段肠道的开始端插入管子,在结尾处开口插入管子。用蠕动泵同时将含有盐酸异丙嗪和酚红的肠灌流液体灌入各个肠段,首先用0.9%氯化钠溶液以2 mL·min^-1流速快速灌流肠段,清洗完毕后,更换为含有盐酸异丙嗪和酚红的肠灌流液,流速更改为0.2 mL·min^-1,平衡10 min,每隔10 min收集一次液体,总共收集120 min,最后测定灌流肠段的长度和内径,收集样品之后以12 000 r·min^-1离心10 min,取上清液,经孔径0.45 μm滤膜滤过,HPLC进样20 μL测定。

手术剪取大鼠新鲜小肠段约20 cm,剖开并用0.9%氯化钠溶液冲净,置正常大鼠空白肠循环液 中,37 ℃水浴中孵育,分别加入盐酸异丙嗪溶液,使终浓度分别为10,20,40 μg·mL^-1,分别于0,2 h取样,测定不同时间点药液中盐酸异丙嗪的含量,计算其降解残存百分率实验。结果表明灌流管和肠壁对盐酸异丙嗪基本没有物理吸附作用。结果见表3。

由于肠道对灌流液的溶剂有吸收,会导致实验结果的偏差,因此,采取酚红质控法对灌流液的流入和流出的体积进行校正,消除其体积变化给实验结果带来的影响。在体大鼠单向肠灌流实验中所计算吸收速率常数(K_a)和表观吸收系数(P_app)的计算公式分别为:

K_a= 1 - C pro , out C pro , in C pr , in C pr , out Q V ,P_app= - Qln ( C pro , out C pro , in C pr , in C pr , out ) 2 πrl

公式中:C_pro,in和C_pro,out分别为肠道进出口灌流液中异丙嗪的浓度(μg·mL^-1),C_pr,in和C_pr,out分别为肠道进出口灌流液中酚红的浓度(μg·mL^-1);l和r分别为灌流肠段的长度(cm)和横截面半径(cm),Q为灌流速度(0.2 mL·min^-1);V为灌流肠段体积(cm³)。

分别考察盐酸异丙嗪在每个浓度(25,50,100 μg·mL^-1)条件下,在大鼠各个肠段的吸收参数的差异性。实验结果显示不同浓度盐酸异丙嗪在十二指肠、空肠、回肠及结肠的吸收参数差异有统计学意义。十二指肠段和回肠段随着浓度的增加,同一肠段的K_a和P_app都显著增加,高浓度没有饱和性,表明在十二指肠段和回肠段没有自身浓度抑制作用;而空肠段在中浓度即可以发现K_a和P_app即达到最大值,然后随着浓度的增大,反而变小,表明随着盐酸异丙嗪浓度的增大,启动某种机制,进行抑制作用;结肠段随着浓度的增加,K_a和P_app一直没有显著变化,几乎保持不变,表明结肠段具有吸收饱和性。结果见表4。