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医药导报, 2017, 36(10): 1112-1115
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2017.10.006
类肉毒多肽的合成与祛皱效果*
Synthesis and Anti-wrinkle Efficacy of Botox-like Polypeptide
丁文锋, 吕庆琴, 张继勇, 赖燕敏, 陈言荣

摘要:

目的 寻找一种具有显著类肉毒作用而淡化皱纹抗衰老的多肽,用于医疗美容领域和皮肤科药物领域。方法 采用多肽合成技术,通过对已经上市SYN-AKE化合物的结构式进行改造,合成一系列新的化合物。采用人肌细胞和来自小鼠胚胎脊髓神经元共培养模型模拟肌肉收缩,进行效果测试。结果 优选6种新合成多肽,H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基(C19H30N5O4)在1 min肌肉收缩次数变化率低于SYN-AKE(P<0.05)。结论 H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基有望成为抗皱抗衰领域医疗美容新原料及皮肤科药物。

关键词: 活性多肽 ; 类肉毒作用 ; 抗皱作用 ; 抗衰作用 ; 肌肉收缩

Abstract:

Objective To develop a new botox-like polypeptide with anti-wrinkle and anti-aging functions, which will be used in the field of cosmetics and dermatology. Methods A series of new peptide compounds were synthesized via modifying the structure of SYN-AKE by peptide synthesis technology. Simulating muscle contraction by using co-culture model of human muscle cells and mouse embryonic spinal cord neurons to test the effects. Results Six new synthetic peptides were selected. The results showed that the muscle contraction frequency was lowered by adding C19H30N5O4 compound than adding SYN-AKE in 1 min(P<0.05). Conclusion C19H30N5O4 is expected to become a new cosmetic peptide raw material and dermatology drug in the field of anti-wrinkle and anti-aging.

Key words: Active polypeptide ; Botox-like ; Anti-wrinkle ; Anti-aging ; Muscle contraction

皱纹是皮肤衰老的结果。皮肤衰老不仅直接影响着皮肤组织的正常结构和生理机能,而且间接影响机体内外环境的稳定,导致新陈代谢不同程度的失衡,可能促进和加快机体的衰老,甚至死亡。正常情况下肌肉收缩过程是:神经冲动-乙酰胆碱(Ach)-终板电位-肌肉动作电位-肌肉收缩。皱纹是由于表情肌连年累月长期反复收缩而形成[1]。研究显示,阻断信号传递是改善皱纹产生的方法之一。A型肉毒毒素(botox)特异作用于周围胆碱能运动神经元的突触前膜,抑制钙离子介导的乙酰胆碱释放,从而降低肌张力,缓解肌肉收缩。1989年,美国食品药品管理局(FDA)正式批准A型肉毒毒素作为新药,用于治疗斜视、眼睑痉挛、四肢肌肉痉挛、痉挛性脑瘫等[2-3]。在20世纪90年代后,随着对其研究深入,发现注射A型肉毒毒素可减轻患者头面部皱纹[4],因此A型肉毒毒素被广泛应用于整形美容外科[2]。然而注射A型肉毒毒素不当引起面瘫、肌肉僵硬、疼痛等副作用已众所周知。近年来,国外科学家发现并证实与皮肤组织细胞相关多肽在皮肤抗衰老中作用,多肽逐渐成为抗衰祛皱的新原料并被大众接受。一种新的合成多肽——乙酰六肽-8(也名阿基瑞林)作用类似A型肉毒毒素,具有抗皱作用[5],安全性高,但效果不明显。2006年,帝斯曼(DSM)全资子公司彭特法姆(pentapharm)从天然蛇毒里提取出一种三胜肽蛋白,比A型肉毒毒素更安全有效,之后研发的产品以Syn-ake命名上市[6-7]。笔者以具有类肉毒作用的多肽为研究对象,通过对其结构进行修饰改造并探索祛皱效果,报道如下。

1 材料
1.1 药物与试剂

2-Cl-Trt 树脂(天津南开合成科技有限公司,批号:G55Q0411,规格SUB=1.1 mmol·g-1);Fmoc-Dab(Boc)-OH(批号:GLS150701-22114,含量:98.67%)、Fmoc-Hyp-OH(批号:GLS140846-30401,含量:98.89%)、Boc-β-Ala-OH(批号:GLS140703-30103,含量:98.33%),均购自吉尔生化(上海)有限公司,HOBT·H2O(购自贵州吴帆生物科技有限公司,批号:20150401,含量:99.9%);DIPEA为化学纯,购自淄博天堂山化工有限公司,批号:20150718;二氯甲烷(dichloromethane,DCM)(化学纯,广州朗艺化工有限公司,批号:20150420);N-N-二甲基酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)(化学纯,广州朗艺化工有限公司,批号:150423);苄胺(分析纯,国药集团化学试剂有限公司,批号:8001612720141216);N-甲基吗啉(分析纯,国药集团化学试剂有限公司,批号: 8008442720150309);乙酸乙酯(分析纯,广州朗艺化工有限公司,批号:GB20150425);甲醇(分析纯,上海星可试剂有限公司,批号:021450301); 碳酸氢钠、氯化钠、硫酸氢钾为分析纯,购自广州西陇化工有限公司;第三次传代正常人肌细胞(成肌细胞);具有“背根神经节”出生10 d小鼠胚胎的脊髓外植体;Syn-ake(INCI名称:dipeptide diaminobutyroyl benzylamide diacetate,彭特法姆股份公司)。

1.2 仪器

高效液相色谱仪(日本岛津,型号:LC2030);固相合成柱(北京欣维尔玻璃仪器有限公司);高分辨电喷雾四级杆-飞行时间质谱仪(德国BURKER公司);磁共振波谱仪(德国BURKER公司);傅里叶红外分光光度计(英国PE公司) ;红外分光光度计(日本SHIMADZU公司);磁力搅拌器(IKA);电感耦合等离子体质谱(美国PE公司);离子阱多级质谱仪(德国BURKER公司)。

2 方法与结果
2.1 多肽的合成

参考文献[8],设计多肽结构式,然后分析所设计的多肽结构,确定合成工艺。从合成的多肽中,优选几种进行功效测试。

2.1.1 Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt 树脂的制备 称取2-Cl-Trt树脂 80 g(88 mmol)和 Fmoc-Dab(Boc)-OH 38.75 g(88 mmol),加入磨口圆底烧瓶中,加入N,N-二异丙基乙胺(ethyldisopropylamine,DIPEA)157 mL(88 mmol)和 DCM 800 mL,摇匀,密封后在摇床上震荡反应17 h。用DMF洗涤树脂,加入 DCM 850 mL,甲醇 100 mL,DIPEA50 mL,混合液封闭20 min。封闭结束后用DMF600 mL洗涤树脂4次,DCM 600 mL洗涤树脂2次。抽滤溶剂。给予甲醇600,300,300 mL收缩树脂3次。真空抽干。称定质量为91.75 g。干燥后低温保存,制得化合物。

2.1.2 Fmoc-Hyp-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备 精密称取干燥Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂91.75 g(40 mmol),置于固相反应合成柱中。 DCM800 mL溶胀树脂20 min,抽滤。DMF400 mL洗涤树脂3次。用20%piperidine/DMF400 mL脱Fmoc 2次。先后用DMF400 mL洗涤树脂4次,DCM 400 mL洗涤树脂2次。抽走溶剂。称取Fmoc-Hyp-OH、HOBT·H2O置于干燥500 mL广口三角瓶中。加适量DMF溶剂溶解。置于冰水浴中冷却。加DIC活化3 min,避免水汽。将活化后氨基酸加入上一步树脂中反应2 h。抽走反应液。用适量DMF洗涤树脂,每次2 min,洗涤3次。

2.1.3 Boc-β-Ala-Hyp-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备 Fmoc-Hyp-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂用20%piperidine/DMF400 mL脱Fmoc二次。DMF 400 mL洗涤树脂4次,DCM 400 mL洗涤树脂2次。抽走溶剂。称取Boc-β-Ala-OH、HOBT·H2O置于干燥500 mL广口三角瓶中。加适量DMF溶剂溶解。置于冰水浴中冷却。加DIC活化3 min,避免水汽。将活化后氨基酸加入上一步树脂中反应2 h。抽走反应液。用适量DMF洗涤树脂,每次2 min,3次。

2.1.4 Boc-β-Ala-Hyp-Dab(Boc)-OH的制备 称取干燥至恒重的Boc-β-Ala-Hyp-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂肽树脂,加适当三氟乙醇裂解液(0.1 g·mL-1)切割反应45 min。反应结束后,用砂芯漏斗滤过,分离树脂。将滤液旋干,得到全保护粗肽。置于真空干燥器干燥至恒重。

2.1.5 Boc-β-Ala-Hyp-Dab(Boc)-NH-Bzl的制备 Boc-β-Ala-Hyp-Dab(Boc)-OH,HOBT用无水四氢呋喃250 mL溶解,冷至0 ℃,缓慢加入DCC,0 ℃搅拌5 min,然后加入苄胺及N-甲基吗啉。0 ℃搅拌2 h,用N-甲基吗啉维持pH值8~9,室温搅拌12 h,薄层色谱(TLC,三氯甲烷:甲醇:乙酸=20:1:0.4)显示原料点消失。反应混合物滤过,滤液减压浓缩,残留物用石油醚反复研磨,得到固体,加乙酸乙酯1 500 mL溶解,分别用饱和碳酸氢钠溶液(75 mL×3),饱和氯化钠溶液(75 mL×1),5%硫酸氢钾溶液(75 mL×3),饱和氯化钠溶液(15 mL×3)洗涤,有机层用无水硫酸钠干燥,滤过,滤液减压旋干得到粗品(产率98%)。

2.1.6 HCl·H-β-Ala-Hyp-Dab-NH-Bzl的制备 Boc-β-Ala-Hyp-Dab(Boc)-NH-Bzl,0 ℃下缓慢加入4 mol·L-1盐酸/乙酸乙酯250 mL,于0 ℃搅拌1.5 h,反应液出现大量沉淀,薄层色谱(TLC,三氯甲烷:甲醇=10:1)显示原料点消失,滤过,沉淀用乙酸乙酯(50 mL×3)和无水乙醚(50 mL×3)反复洗涤至无盐酸,得目标化合物粗品(85%)。

2.2 精制

采用C18反相柱纯化脱盐。粗品预处理:60 g HCl·H-β-Ala-Hyp-Dab-NH-Bzl分成5份,分别用纯化水5 mL溶解,滤过。 填料:C18,柱长800 mm,内径50 mm。洗脱条件:梯度洗脱,流速2 mL·min-1,先用2%乙腈-1%乙酸水溶液洗脱,硝酸银溶液检测氯离子,接收液无氯后换为10%乙腈-1%乙酸水溶液,1 h后再转换为15%乙腈-1%乙酸水溶液。收集样品:采用薄层色谱(TLC)茚三酮显色方法检测样品流出情况,并根据高效液相色谱(HPLC)法检测数据收集主成分,合并洗脱液,冷冻干燥24 h后,再次加入纯化水溶解,冻干48 h,得终产品白色冻干粉末(产率68%,含量99.8%)37 g。

2.3 合成结果

根据以上方法制备一系列多肽化合物,优选化合物见表1。

表1 优选的多肽化合物
Tab.1 Optimized poly peptide compounds
化合物 结构式 分子式 分子量
化合物1 H-(β-Ala)-Hyp-Arg-NH-苄基 C22H36N7O 462.57
化合物2 H-(β-Ala)-Hyp-Gln-NH-苄基 C21H32N5O5 434.51
化合物3 H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基 C19H30N5O4 392.47
化合物4 H-(β-Ala)-Hyp-Glu-NH-苄基 C21H31N4O6 435.49
化合物5 H-(β-Ala)-Hyp-Ser-NH-苄基 C19H29N4O5 393.46
化合物6 H-(β-Ala)-Hyp-Lys-NH-苄基 C22H36N5O4 434.55

表1 优选的多肽化合物

Tab.1 Optimized poly peptide compounds

2.4 抗皱作用评价

2.4.1 建立培养模型 将正常成肌细胞置于含2/3MEM和1/3M199、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、50 U·mL-1青霉素、50 μg·mL-1链霉素、5%胎牛血清培养基中,于37 ℃、5%二氧化碳,且明胶包被的平板中培养,直到形成单层肌原纤维。然后将具有背根神经节出生10 d的小鼠胚胎的脊髓外植体置于所述肌细胞单层上,共培养48 h后,观察到从外植体生长出的神经突与肌细胞接触,100 h后开始发生收缩。共培养4周,神经和肌肉已经充分连接,形成具有完全成熟的神经肌肉接头(相当于具有运动终板)充分分化的横纹肌纤维模型,在这一阶段,肌原纤维可以进行规律的收缩。

2.4.2 测试方法 加入化合物前,先用显微镜观察培养模型肌肉收缩频率30 s,观察5次,计数,取平均值。接着将待测试多肽和Syn-ake在培养基中稀释成不同浓度后,分别加入培养模型中。另外再设空白对照组。在1 min、2 h和48 h时观察肌肉收缩频率各30 s,并计数,记录结果[8]。见表2。

2.4.3 多肽效果测试结果 化合物加入后1 min、2 h和48 h肌肉收缩次数变化百分数,结果见表2。对化合物3和Syn-ake在1 min的肌肉收缩次数变化百分数进行均值t检验分析,两者在相同浓度下比较差异有统计学意义(P<0.05),证明化合物3具有更强的活性及更好的祛皱效果。

表2 不同浓度化合物在不同时间诱导肌肉收缩的次数
Tab.2 Times of muscle contraction induced by different concentration of peptide compound at different time point
产品编号 浓度/
(mmol·L-1)
1 min 2 h 48 h
对照组 107 103 97
Syn-ake 1.0 37 6 0
0.5 86 7 5
0.1 83 26 10
化合物1 1.0 40 7 0
0.5 58 15 1
0.1 91 21 8
化合物2 1.0 95 78 67
0.5 109 93 72
0.1 105 105 98
化合物3 1.0 5 0 0
0.5 13 0 0
0.1 34 8 3
化合物4 1.0 92 68 36
0.5 85 65 25
0.1 99 77 45
化合物5 1.0 56 30 5
0.5 77 16 17
0.1 90 33 26
化合物6 1.0 45 12 5
0.5 67 26 6
0.1 88 19 13

表2 不同浓度化合物在不同时间诱导肌肉收缩的次数

Tab.2 Times of muscle contraction induced by different concentration of peptide compound at different time point

2.5 结构确证

利用磁共振谱图、质谱、红外谱图等对化合物3进行结构确证,确定化合物的结构式及分子式。初步确定其分子式为C19H30N5O4。见图1,2,3,4。

图1 化合物3磁共振谱图(H谱)

Fig.1 Nuclear magnetic resonance spectrum of NO.3 peptide compound(H spectrum)

图2 化合物3磁共振谱图(C谱)

Fig.2 Nuclear magnetic resonance spectrum of NO.3 peptide compound(C spectrum)

图3 化合物3质谱图

Fig.3 Mass spectrogram of NO.3 peptide compound

图4 化合物3红外光谱图

Fig.4 Infrared spectrum of NO.3 peptide compound

3 讨论

具有类肉毒作用化合物已经被广泛应用于抗皱抗衰老领域,较知名的药物有A型肉毒毒素和小分子多肽,如阿基瑞林、Syn-ake。A型肉毒毒素通过专一阻断乙酰胆碱在神经-肌肉接头处的释放引起肌肉放松而达到祛皱的目的。毒素结合到神经元细胞膜,通过细胞钙和pH值依赖易位过程进入细胞,以温度和锌离子依赖方式阻断SNARE位点。但A型肉毒毒素治疗必须在严密观察下进行,因为这种毒素是迄今为止发现毒性最强的毒素,且需要持续注射才能不断保持祛皱效果(临床作用一般维持3~6个月)[2]。为了突破毒性限制,通过小分子肽模拟A型肉毒毒素引起人们很大兴趣。从这一点出发,合成肽效仿SNAP-25氨基酸序列显示出专一抑制神经分泌活动。阿基瑞林,即乙酰六肽-8具有良好祛皱作用[5],由SNAP-25 N末端区域衍生而来,干扰SNARE三元复合体的组合,且抑制钙依赖的铬细胞儿茶酚胺释放[6],可祛皱效果较弱。SYN-AKE来自Wagler毒蛇的Waglerin-1毒液[7,9],是一个22-氨基酸肽选择性结合Ach受体(nAChPs),作用于突触后膜,是可逆性nAChR拮抗剂,通过结合到nAChP的小亚单位达到阻止Ach与受体结合,从而抑制肌肉收缩[6-7],可减少肌肉收缩频率达82%[9]

笔者借鉴上述研究成果,利用多肽合成技术,对上市的Syn-ake化合物结构式进行改造,合成一系列模拟蛇毒毒素WaglerinⅠ活性的小分子多肽,通过抑制肌肉收缩而减少皱纹的产生,具有显著类肉毒作用。体外培养正常的人肌细胞(成肌细胞)与背根神经节模拟肌肉收缩试验显示,化合物3收缩频率低于Syn-ake,说明化合物3祛皱效果优于Syn-ake。对化合物3进行进一步的化学结构确证,从磁共振谱图、质谱、红外谱图确定其结构式,其INCI命名beta-alanyl hydroxyprolyl diaminobutyroyl benzyla mide已经通过国际化妆品原料委员会审批。后期将对其作用机制、毒理药理、皮肤刺激性等进行进一步的研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

[1] 虞瑞尧. 肉毒毒素注射上面部除皱的解剖学基础[J].中华医学美学美容杂志,2007,13(6):379-380.
篇首: 面部表情肌是最丰富的部位,所有人的喜、怒、衰、乐感情,多需通过面部表情肌收缩表现出来,皱纹是由于面部表情肌连年累月长期收缩而形成,由肌肉收缩而引起的皱纹称动力性皱纹.
[本文引用:1]
[2] 谭蔚锋,唐吴,邢新,.A型肉毒毒素在整形美容外科中的应用进展[J].中华医学美学美容杂志,2003,9(3):187-189.
URL    
[本文引用:3]
[3] 王雅洁,韩仰同.A型肉毒毒素治疗痉挛型脑性瘫痪[J].国外医学(儿科学分册),2001,28(9):265-267.
URL    
[本文引用:1]
[4] 程喜平. A型肉毒毒素除去老年人皱纹临床疗效观察[J].临床皮肤科杂志,2003,32(5):290-291.
URL    
[本文引用:1]
[5] RUIZ M A,CLARES B,MORALES M E,et al.Evaluation of the anti-wrinkle efficacy of cosmetic formulations with an anti-aging peptide (Argireline)[J].Ars Pharm,2010,50(4):168-176.
Abstract The purpose of this research was to evaluate, by means of in vivo studies, the efficacy of new cosmetic active ingredients which effect of botox, called Argireline庐), so that width and depth of wrinkles could be established. For this, it is prepared two formulations: an emulsion with an external aqueous phase for normal to dry skin, and a gel for oily skin. We likewise study the water content of the skin after the application of both formulas, as this must be one of the priority functions of facial treatments in general, as well as the level of satisfaction from the subjective point of view, fundamental for patients and their continuation of the treatment. After the designed tests, it is possible to verify that there is a remarkable diminution of the wrinkles size tested in each patient during the month of treatment. Besides, it is possible to review how the moisturizing capacity has been increased in all cases. At the end of the visual test, all the volunteers experienced a reduction in the depth of wrinkles, and from the subjective point of view, the appearance and elasticity of the skin were improved. Finally it is possible to conclude that Argireline庐 (acetyl hexapeptide-8) shows a great antiaging capacity in all the cases that have been studied and the tried compounds have increased moisturizing power.
URL    
[本文引用:2]
[6] ZHANG L J,FALLA T J.Cosmeceuticals and peptides[J].Clin Dermatol,2009,27(5):485-494. [本文引用:3]
[7] BALAEV A N,OKHMANOVICH K A,OSIPOV V N.A shortened,protecting group free,synthesis of the anti-wrinkle venom analogue Syn-Ake exploiting an optimized Hofmann-type rearrangement[J].Tetrahedron Lett,2014,55:5745-5747.
An unusual five-step synthesis of H-尾-Ala-Pro-DabNHBz diacetate (a muscular nicotinic acetylcholine receptor antagonist) has been delineated through Hofmann-type rearrangement as a final step to build the target skeleton. The synthesis has been carried out using a protecting group free strategy and employed readily available reagents as the starting materials.
DOI:10.1016/j.tetlet.2014.08.117      URL    
[本文引用:3]
[8] 彭特法姆股份公司.新型可局部施用的抗表情皱纹和与年龄相关的皱纹的活性物质: CN101061134A[P].2007-10-24.
[本文引用:1]
[9] GOROUHI F,MAIBACH H I.Topical peptides and proteins for aging skin[M].Berlin:Springer-Verlag Berlin Heidelberg,2010:1089-1117.
[本文引用:2]
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活性多肽
类肉毒作用
抗皱作用
抗衰作用
肌肉收缩

Active polypeptide
Botox-like
Anti-wrinkle
Anti-aging
Muscle contraction

作者
丁文锋
吕庆琴
张继勇
赖燕敏
陈言荣

DING Wenfeng
LYU Qingqin
ZHANG Jiyong
LAI Yanmin
CHEN Yanrong