目的 研究麦角甾醇的抗血小板聚集作用及机制。方法 采用家兔体外血小板聚集实验方法,观察麦角甾醇对二磷酸腺苷(4 μmol·L-1)、胶原蛋白(4 μg·mL-1)、花生四烯酸(1 mmol·L-1)和凝血酶(0.5 U·mL-1)诱导体外血小板聚集的抑制活性;麦角甾醇与奥扎格雷、双嘧达莫、氯吡格雷和阿司匹林联合应用体外抗二磷酸腺苷(0,1,2,4,6 μmol·L-1)与纤维蛋白原(0,1,2,4,6,10 mg·mL-1)诱导血小板聚集作用。结果 麦角甾醇对各诱导剂二磷酸腺苷、胶原蛋白、花生四烯酸、凝血酶抑制作用的半数抑制浓度(IC50值)分别为( 19.3±0.8),(23.4±1.2),(26.7±0.7) ,(32.9±1.5 ) μmol·L-1。麦角甾醇抑制二磷酸腺苷及纤维蛋白原诱导聚集作用的协同相关性的线性最佳为双嘧达莫与氯吡格雷。结论 麦角甾醇能显著抑制血小板聚集及其功能活化,为麦角甾醇资源的充分开发及研制新的抗血小板聚集药物提供实验依据。
Objective To evaluate the anti-platelet aggregation effect of ergosterol
麦角甾醇(ergosterol)又称麦角固醇,主要存在于酵母菌、多孔真菌、真菌等菌类和某些植物中,是一种重要的甾醇物质和生产甾体激素药物的重要原料,具有广泛的生理作用[1-2]。现代药理学研究表明麦角甾醇具有利尿、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性[3-7],但目前麦角甾醇及其衍生物对抗血栓药理作用研究笔者尚未见报道。为寻找更多的具有抗血栓的备选化合物及扩大药源,本课题组前期研究确定药用真菌猪苓中麦角甾醇为抗血小板聚集的活性物质,现拟以抗血小板聚集为研究切入点,在血小板聚集发生的生理过程,初步肯定麦角甾醇抗血栓作用,并对其抗血小板聚集作用和机制进行探索,为麦角甾醇资源的充分开发及研制一种新的抗血小板聚集药物提供初步实验依据。
新西兰兔,体质量2.0~2.5 kg;雌雄各半,无特定病原体(SPF)级,均购自湖北省实验动物研究中心,实验动物生产许可证号:SCXK(鄂)2015-0018。动物饲养于湖北中医药大学中医药实验中心,饲养环境为常规日夜周期,室温(22±2) ℃,相对湿度 (50±2)%,单笼饲养,自由进食饮水。实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2012-0067。
560-CA血小板聚集测试仪(美国CHRONOLOG公司),TGL-18C飞鸽台式离心机(上海安亭飞鸽仪器有限公司),EL204 万分之一电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司],HH-6数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)、KQ3200B型超声仪波清洗器(昆山市超声仪器厂),真空采血管(武汉成龙科贸有限公司)。
1.3.1 药物 阿司匹林片(德国拜耳制药公司,批号:20160122,规格:每片100 mg),双嘧达莫片(广东华南制药厂,批号:101104,规格:每片25 mg),氯吡格雷片(法国赛诺菲制药公司,批号:20150211,规格:每片75 mg),注射用奥扎格雷钠(哈药集团生物工程有限公司,批号:20160819,每支20 mg)。
1.3.2 试药 戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司,批号:20141029,含量﹥99.0%);枸橼酸钠(国药集团化学试剂有限公司,批号:20150412,含量为99.0%);二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)(芜湖华仁科技有限公司,批号20150218,含量≥98.0%)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)(百灵威科技有限公司,批号:20150923,含量为99.0%)、凝血酶(thrombin,THR)(武汉易泰科技有限公司,批号:20160322,含量为99.0%)、胶原蛋白(collagen,COL)(武汉易泰科技有限公司,批号:20151011,含量为99.0%)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)(上海宝曼生物科技有限公司,批号:20150527,含量为99%)。麦角甾醇(西安万方生物科技公司,批号:20150201,含量>98%)。
取新西兰家兔,参考文献[8-12]方法进行,以3%戊巴比妥钠 (1.5 mL·kg-1) 麻醉,颈总动脉采血,3.8 %枸橼酸钠 1:9 抗凝,混匀,1 000 r·min-1(
体外抗血小板聚集实验 取家兔颈动脉血样,参考文献[13-14]方法,制备PRP、PPP(制备方法同“1.4”项)。将未洗涤PRP与奥扎格雷(4.5 mmol·L-1)、氯吡格雷(1.2 mmol·L-1)、阿司匹林 (2.0 mmol·L-1)、双嘧达莫(1.0 mmol·L-1 )在37 ℃下孵育20 min,再加入麦角甾醇(10 μmol·L-1)继续孵育10 min,测定加入ADP(0,1,2,4,6 μmol·L-1)、FIB (0,1,2,4,6,10 mg·mL-1)诱导3 min后最大血小板聚集率,观察其对不同阻断剂作用后对ADP与FIB诱发的血小板聚集的影响。
采用SPSS 20.0版统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(
结果见
麦角甾醇与奥扎格雷(TXA2抑制药),阿司匹林(COX 环氧酶抑制药)、氯吡格雷(P2Y12受体抑制药)、双嘧达莫(PDE抑制药)联用于ADP诱导的体外抗血小板聚集作用,都能体现出其抑制作用。由于不同阻断剂的作用机制不同,因此可以根据抑制曲线的线性关系来评价其之间的相关性,线性关系即可预示出协同作用关系。结果见
麦角甾醇在真菌中广泛存在,其药理活性多样,本实验探讨麦角甾醇的抗血小板作用及初步机制,设计市面常用的抗血小板药物与体内诱导聚集的主要活性物质,从正反两方面论证麦角甾醇的抗血小板活性与可能机制。由于ADP为常见诱导血小板聚集因素,抑制ADP诱发的聚集可以降低较大的血栓形成风险[15-16],此外FIB作用于血小板聚集的最后环节,因此对FIB的聚集抑制能具有一定说服力的实验依据。
本研究表明:麦角甾醇对家兔体外血小板聚集中表现出显著的抑制聚集作用,且能对多种血小板聚集诱导剂都体现出协同作用。实验拟从体外抗血小板聚集实验发现麦角甾醇对不同血小板聚集诱导剂抑制作用之间的差异,观察麦角甾醇对不同途径血小板聚集的影响。仅从麦角甾醇对各诱导剂的 IC50值比较,其差异较少或不存在差异。但从整个浓度梯度所得出的量效曲线分析,反映麦角甾醇对ADP所引起的血小板聚集量效关系最为明显。因此,能从一定层面上说明其与ADP诱发的血小板聚集关系较其他诱导剂紧密。
麦角甾醇与上述阻断剂可能存在相似作用途径,特别对于PDE抑制剂及P2Y12受体抑制剂联用能体现出明显量效关系,说明其作用途径与cAMP及 P2Y12受体关系密切。此外,上述实验可以反推测麦角甾醇对 P2Y12受体抑制作用与 cAMP变化可能存在较为直接关系。本实验结果表明麦角甾醇能显著抑制血小板聚集及其功能活化,且可能与cAMP含量变化及P2Y12受体有关,推测其可能为麦角甾醇抗血小板聚集作用的靶点。
综上所述,麦角甾醇具有较显著的抗血小板聚集活性,且对于血小板聚集发生的关键环节与主要诱导物质均有不同程度的抑制作用。由于实验条件有限,没有探讨麦角甾醇对凝血酶原时间、血栓素A2及血管内皮保护等的影响,由于机体在不同生理与病理情况下药物会有不同的作用趋势,因此有必要在病理动物模型进一步研究麦角甾醇的抗血小板作用及其药理机制。
The authors have declared that no competing interests exist.