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医药导报
医药导报, 2017, 36(10): 1194-1197
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2017.10.026
重症监护病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及危险因素*
熊祝嘉, 张宁, 李玮, 段志玲, 李小瑛
煤炭总医院检验科,北京 100028

作者简介 熊祝嘉(1981-),男,四川绵阳人,副主任技师,硕士,研究方向:临床病原菌实验室诊断、耐药机制及其分子流行病学。电话:010-64667755-2210,E-mail:xzjiaxzjia@163.com。
基金资助: 煤炭总医院院内课题(K201210)
中图分类号: R978     文献标识码: B     文章编号: 1004-0781(2017)10-1194-04
摘要:

目的 调查耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分子流行病学、耐药性特征及感染危险因素,采取相应干扰措施,降低MRSA的感染率。方法 调查2014—2015年煤炭总医院重症监护病房,采用葡萄球菌蛋白A基因(spa)分型技术对分离53株MRSA进行分子流行病学研究,同时分析药物敏感试验结果。然后采用1:2成组病例对照方法选取同时期苯唑西林敏感金黄色葡萄球菌感染患者作为对照组,对MRSA感染的危险因素进行分析。结果 53株MRSA的分子克隆型全部为t030。MRSA敏感性最高的抗菌药物为万古霉素、替考拉宁、甲氧苄啶和复方磺胺甲唑(100.0%)。Logistic回归分析显示,静脉插管和气管插管是MRSA感染的独立危险因素。结论 该院重症监护病房MRSA克隆株由t030引起。MRSA耐药性强,静脉插管和气管插管等有创性治疗是MRSA感染的独立危险因素。
关键词: 金黄色葡萄球菌 ; 耐甲氧西林 ; 葡萄球菌蛋白A基因分型 ; 中心静脉置管 ; 气管插管 ; 危险因素

Abstract:

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是人类面对的第一种超级细菌。MRSA一直是院内感染常见致病菌,其与碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant acinetobacter baumannii,CRAB)和耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant pseudomonas aeru-ginosa,CRPA)并列为重症监护病房(intensive care unit,ICU)三大多重耐药菌[1-2]。并且MRSA能出现在各种类型的院内感染中,包括气管插管、尿道插管以及静脉置管中[3]。这是因为葡萄球菌属细菌能形成生物膜,定植在腔道表面。生物膜可帮助金黄色葡萄球菌在腔道表面存活,并且延长细菌暴露在抗菌药物中的时间从而诱导其形成耐药菌株[4-5]。笔者对本院ICU中MRSA的流行情况及对常用抗菌药物的耐药情况进行分析,以期找到影响MRSA感染传播的危险因素,从而帮助制定有效的医院感染控制措施。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 菌株来源 MRSA菌株来自2014年1月—2015年12月我院ICU住院患者。53例患者在进入ICU前均未检出MRSA。53例患者中男40例,女13例,患者年龄14~83岁。心血管系统疾病13例

(24.5%),肿瘤晚期10例(18.9%),呼吸道感染疾病7例(13.2%),严重创伤6例(11.3%),外科手术、脑卒中各5例(均9.4%),消化道出血4例(7.5%),肾衰竭3例(5.7%)。53株MRSA中,来自痰标本30株(56.6%),血培养来源10株(18.9%),中段尿培养、支气管毛刷、伤口分泌物各3株(均5.7%),静脉置管、肺泡灌洗液各2株(均3.8%)。

1.1.2 仪器与设备 Phoenix-100全自动细胞鉴定系统(美国BD公司,细菌的鉴定和药敏试验),荧光聚合酶链反应(PCR)仪(瑞士罗氏公司,型号:Light cycler480),荧光PCR所用引物及反应体系所需试剂由北京梓熙生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定和药敏试验 53株MRSA菌株经过Phoenix-100全自动细菌鉴定仪鉴定并进行药敏试验,药敏结果判定参照2014年美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南。实时荧光定量PCR检测16S rRNA基因中葡萄球菌特异的靶点、金黄色葡萄球菌特异性靶基因femA及耐药决定基因mecA进行菌种复核。当16S rRNA基因、femA基因和mecA基因全部阳性且头孢西丁最低抑菌浓度(minimal inhibition concentration,MIC)值≥ 8 mg·L-1时判定为MRSA。

1.2.2 荧光PCR 采用Lysostaphin裂解煮沸法制备DNA模板,16S rRNA、femA、mecA和spa基因分型所用引物参照文献[6]进行设计,荧光染料SYBR Green I,反应体系20 μL。PCR反应条件为90 ℃变性 30 s,90 ℃变性 20 s,60 ℃退火 20 s,72 ℃延伸30 s,40个循环,72 ℃5 min,95 ℃1 min,60 ℃ 30 s.

1.2.3 spa基因序列 按官方网站Ridom SpaSever(http://www.ridom.de/spasever)的要求编辑后对结果进行对比分析并确定型别,结果以t加3位或4位阿拉伯数字表示。

1.2.4 MRSA感染危险因素分析 设计调查表,收集53株MRSA感染患者的病案资料,采用1:2成组病例对照方法选取同时期非MRSA感染患者作为对照组。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23版统计软件对数据进行统计分析。采用单因素和多因素非条件Logistic回归分析危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 spa分型结果

53株MRSA的spa基因正向测序结果进行基因对比,他们的序列均为15-12-16-02-24-24,将序列号输入官方网站Ridom SpaSever(http://www.ridom.de/spasever) 进行对比,得到spa基因型为“t030”,属于CC8克隆复合体。

2.2 药物敏感性测定

结果见表1。

表1 53株MRSA对17种抗菌药物的耐药率
抗菌
药物		 耐药
菌株		 耐药
率/%		 抗菌
药物		 耐药
菌株		 耐药
率/%
青霉素 53 100.0 复方磺胺甲 唑 0 0.0
氨苄西林 53 100.0 甲氧苄啶 0 0.0
苯唑西林 53 100.0 克林霉素 30 56.6
阿莫西林/克拉维酸 53 100.0 红霉素 33 62.3
阿米卡星 51 96.2 呋喃妥因 2 3.8
庆大霉素 50 94.3 利奈唑胺 4 7.5
妥布霉素 50 94.3 万古霉素 0 0.0
利福平 51 96.2 替考拉宁 0 0.0
环丙沙星 51 96.2

表1 53株MRSA对17种抗菌药物的耐药率

2.3 影响住院患者MRSA感染危险的单因素Logistic分析

结果见表2。表2显示MRSA感染的相关危险因素为静脉插管、气管插管和皮肤软组织感染(P<0.05)。

表2 影响住院患者MRSA感染危险的单因素Logistic回归分析
因素 F 显著性 t 自由度 平均值差值 95%CI 标准误差差值
糖尿病 1.83 0.178 -4.084 154 -0.327 (-0.485,-0.169) 0.08
静脉插管 12.444 0.001 -5.066 154 -0.384 62 (-0.534 59,-0.234 64) 0.075 92
至少使用2种抗菌药物 1.481 0.225 -2.647 154 -0.096 15 (-0.386 23,-0.056 08) 0.083 56
住院时间>10 d 1.06 0.0305 -1.134 154 -0.096 15 (-0.263 62,0.071 31) 0.084 77
菌血症 0.08 0.777 0.141 154 0.009 62 (-0.125 13,0.144 36) 0.068 21
使用气管插管 6.551 0.011 -5.447 154 -0.413 46 (-0.563 41,-0.263 51) 0.075 91
放射治疗或化学治疗 1.049 0.307 -0.525 154 -0.038 46 (-0.183 29,-0.106 36) 0.073 31
使用免疫抑制药物 1.166 0.282 -0.583 154 -0.048 08 (-0.211 1,0.114 94) 0.082 52
年龄>60岁 1.123 0.291 -2.105 154 -0.346 15 (-0.670 97,-0.021 34) 0.164 42

表2 影响住院患者MRSA感染危险的单因素Logistic回归分析

2.4 多因素Logistic分析

对上述单因素分析筛选的危险因素进行非条件Logistic分析,静脉插管和气管插管是独立的危险因素,见表3。

表3 影响住院患者MRSA感染危险的多因素Logistic回归分析
项目 B 标准误差 瓦尔德 自由度 显著性
静脉插管 1.837 0.446 16.93 1 0
气管插管 2.08 0.436 22.805 1 0
皮肤软组织感染 0.531 0.422 1.581 1 0.209
常量 -2.604 0.424 37.696 1 0

表3 影响住院患者MRSA感染危险的多因素Logistic回归分析

3 讨论

治疗MRSA感染是一个世界性难题,尤其是近年来医院获得性MRSA(hospital acquired MRSA,HA-MRSA)的增加给临床抗感染治疗带来很大的挑战[7-8]。明确MRSA的分子流行病学特征,有助于理解MRSA在医院内的传播,帮助建立更加有效的院内感染控制措施。目前常用的分型方法有多位点序列分型(multiple locus sequence typing,MLST),SCCmec(staphylococcal cassette chromosome mec)分型,spa分型和被认为是MRSA分型金标准的脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型。这些分型方法各有优缺点。PFGE分型的分辨能力强,但需要特殊仪器设备,技术复杂,耗时长,最大问题是实验室之间无法比较分型结果。MLST多位点序列分析在2000年被应用到金黄色葡萄球菌的研究上。该方法以金黄色葡萄球菌7个管家基因的序列为基础,分型结果可以应用来追踪细菌的长期进化过程,并且结果可以在不同实验室之间进行比较。但由于MLST测定7个管家基因序列,工作量比较大,而且费用较高,这限制MLST在经费有限的实验室中的应用。MRSA的耐药机制主要是它获得含有mecA耐药基因的可移动的遗传元件,称为葡萄球菌染色体盒子,即SCCmec盒子。SCCmec目前有5个大的分型,各个分型中又有具体亚型。到目前为止,还没有一个统一的SCCmec分型标准。随机扩增多态 DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)是美国学者Williams和Welsh于1990年首先提出,该技术是通过分析DNA的PCR产物多态性来推测生物体内基因排布与外在性状表现规律。RAPD技术是以8~10 bp的随机寡核苷酸片段作为引物,对基因组进行PCR扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或PFGE电泳检测,研究DNA的多态性。RAPD可用于细菌的遗传学和流行病学方面的研究,也可用于研究不同地区细菌的基因型和各种表型之间的关系。但RAPD的结果还是不适用于不同实验室之间结果的比较。葡萄球菌spa编码的蛋白是金葡菌细胞壁的组分。该基因的X区呈现多态性,含有不同数量的可变重复序列,重复序列两端为相对保守区域,利用这种基因多态性建立的方法为spa分型,具有操作简便、易于标准化、结果容易解释等特点,在2006年以后已经逐步取代PFGE分型。每种分型都具有优缺点,做临床流行病学分析的实验室可根据自身特点选取一种或几种方法均可。根据笔者前期相关研究,我国医院内MRSA以ST239-t030(41.2%)和ST-t037(28.8%)为主[9]。根据CHEN等[10]对北京协和医院1994—2005年MRSA分子克隆型变迁的回顾性研究中发现,最初广泛流行的克隆型ST239-t037从2000年起被ST239-t030型快速替代。本次对ICU病区获得的MRSA分子流行病学研究和之前本实验室对我院呼吸科肿瘤病房一次MRSA爆发流行的分子流行病学研究结果进一步证实t030流行株目前为主要流行株的事实[11]。刘周等[12]研究发现临床及医院环境中检出的MRSA呈现高度同源性,存在患者与环境间、科室间的交叉传播流行。对已经确诊为MRSA感染的患者要严格执行接触隔离、合理使用抗菌药物,并对患者周围环境设施进行消毒,有效去除环境中定植的MRSA,从根本上防控MRSA在医院内的流性传播。医务人员应该每月开展MRSA筛查工作。对于鼻腔拭子筛查MRSA阳性的医务人员,应督促其接触患者时穿隔离衣,带双重口罩、手套,限制其接触免疫力低下的患者,并且要在其鼻前庭涂抹2%夫西地酸软膏,每天2次,持续7 d。7 d后复查鼻腔拭子。

根据笔者之前研究,spa t030基因型可推定为ST239-t030,其耐药特点是除去对糖肽类抗菌药物保持敏感及对人工合成的唑烷酮类抗菌药物利奈唑胺敏感性较高外,还对甲氧苄啶和复方磺胺甲唑保持敏感[10]。

本次研究表明静脉插管和气管插管是ICU患者MRSA感染的独立危险因素。侵入性操作损伤机体局部防御屏障,增加MRSA感染与定植的概率[13- 14]。因此,对于ICU中新转入的患者或临床高度怀疑MRSA感染的患者,均应该采集鼻腔拭子进行MRSA的筛查。对于筛查阳性的患者,应该及时隔离,并且用夫西地酸涂抹鼻前庭,每日3次,持续3 d。3 d后复查鼻腔拭子。研究表明,实行该措施后,患者的MRSA分离率和感染率明显下降。

从本次研究数据可知,ICU中MRSA的克隆传播非常严重,并且耐药性严重,且主要与中心静脉置管和气管插管等有创性治疗相关。任军红等[15]研究表明,将床头抬高≥30°,尽早停用预防应激性溃疡的药物,每天3次使用复方氯己定含漱液进行口腔护理能有效减小呼吸机相关性肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)的产生。严格执行手卫生,使用抗菌导管,每日用安尔碘消毒穿刺点可以降低导管相关性血流感染(catheter related blood stream infection,CRBSI)的发生。此外,还应进行持续的质量改进,例如提高医务人员手卫生的依从性和正确率,提高无菌操作的执行力等都有助于降低VAP和CRBSI的发生。因此,在需要进行侵入性操作时,应该按照上述原则,预防MRSA的感染。

The authors have declared that no competing interests exist.
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Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection has emerged in patients who do not have the established risk factors. The national burden and clinical effect of this novel presentation of MRSA disease are unclear.We evaluated MRSA infections in patients identified from population-based surveillance in Baltimore and Atlanta and from hospital-laboratory-based sentinel surveillance of 12 hospitals in Minnesota. Information was obtained by interviewing patients and by reviewing their medical records. Infections were classified as community-associated [correction] MRSA disease if no established risk factors were identified.From 2001 through 2002, 1647 cases of community-associated [correction] MRSA infection were reported, representing between 8 and 20 percent of all MRSA isolates. The annual disease incidence varied according to site (25.7 cases per 100,000 population in Atlanta vs. 18.0 per 100,000 in Baltimore) and was significantly higher among persons less than two years old than among those who were two years of age or older (relative risk, 1.51; 95 percent confidence interval, 1.19 to 1.92) and among blacks than among whites in Atlanta (age-adjusted relative risk, 2.74; 95 percent confidence interval, 2.44 to 3.07). Six percent of cases were invasive, and 77 percent involved skin and soft tissue. The infecting strain of MRSA was often (73 percent) resistant to prescribed antimicrobial agents. Among patients with skin or soft-tissue infections, therapy to which the infecting strain was resistant did not appear to be associated with adverse patient-reported outcomes. Overall, 23 percent of patients were hospitalized for the MRSA infection.Community-associated MRSA infections are now a common and serious problem. These infections usually involve the skin, especially among children, and hospitalization is common.
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目的 分析29株血流感染凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的临床意义及耐药性.方法 回顾性分析从2011年1月-2011年12月煤炭总医院临床送检血培养标本中分离出的64株凝固酶阴性葡萄球菌,其中29株确定为血流感染致病菌.结果 64株CNS中,35株CNS判断为污染菌,污染率54.7%.29株血流感染致病菌中,表皮葡萄球菌15株最多,占到51.7%.耐甲氧西林凝固酶阴性 葡萄球菌(MRCNS)20株占69.0%,全部产β-内酰胺酶;甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(MSCNS)9株占31.0%,其中有7株产β-内酰 胺酶(产酶率77.8%).MRCNS除了对万古霉素和利奈唑胺还保持敏感外,对绝大多数抗生素都有较高的耐药率.结论 CNS已为血流感染重要致病菌,污染率高,耐药情况严峻.临床应严格无菌操作,抽双侧两套血培养瓶送检,合理使用抗生素.
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为 了解ICU重症患者感染病原菌情况,为临床提供治疗依据,防止耐药菌的传播,我们收集1999年1月—2005年1月重症监护病房的各类标本的分离菌鉴定 药敏结果,进行总结并及时反馈给临床。共分离出细菌372株,排前6位的为各类真菌112株,铜绿假单胞菌88株,肺炎克雷伯杆菌18株(产ESBL5 株)
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目的调查2007年中国7所教学医院耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的分子流行病学分布及耐药性特征。方法采用多位点序列分型(MLST)和葡萄球菌蛋白A基因(spa)分型技术对114株MRSA进行分子流行病学研究,并进行Panton-Valentine毒素(PVL)编码基因lukS检测,采用琼脂稀释法进行13种抗菌药物的药敏试验。结果 114株MRSA中共发现8种MLST-spa分子克隆型,ST239-t030、ST239-t037和ST5-t002是主要的型别,分别占总数的41.2%、28.8%和21.9%。仅有1株MRSA检测到lukS基因阳性。MRSA菌株最敏感的抗菌药物为万古霉素与替考拉宁(100%),甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑次之(86.8%);主要的分子克隆型ST239-t030、ST239-t037和ST5-t002菌株具有相似的药敏谱,但所有甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑耐药菌株均属于ST239-t037。结论在中国MRSA的流行株由数种主要的分子克隆型引起,与周边国家和地区的情况基本一致。
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[本文引用:1]
[15] 任军红,李六亿,贾会学,等.持续质量改进对ICU导管相关性感染的控制效果[J].中华医院感染学杂志,2012,22(12):2509-2511.
目的 了解持续质量改进对重症监护病房(ICU)导管相关性感染的控制效果.方法 2007年1月-2012年2月在外科重症监护病房(SICU)开展导管相关性感染目标性临测,监测内容包括气管切开使用呼吸机、中心静脉插管和泌尿道插 管的使用率及呼吸机相关性肺炎(VAP)、中心静脉插管相关性血流感染(CLABSI)及泌尿道插管相关性尿路感染(CAUTl)的感染率进行监测；监测 工作中采取综合控制措施并持续质量改进,评价持续改进的效果.结果 通过持续质量改进,2007- 2010年导管相关性感染率明显下降,尤其是VAP感染率下降显著,2010年较2007年明显下降(P=0.00)；改进控制措施实施后,呼吸机使用率 从46.49％降至40.72％,泌尿道插管从93.44％降至88.77％.均明显下降(P=0.00);CAUTI感染率从4.25例/1000导管 日降至0.39例/1000导管日,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 持续质量改进对控制导管相关性感染有重要意义,并可取得较好的效果.
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作者
熊祝嘉
张宁
李玮
段志玲
李小瑛