H-核磁共振定量法测定盐酸厄洛替尼含量

李乘欣, 王雪萍, 崔锋, 郝海军

中国医药工业研究总院上海医药工业研究院分析测试中心,上海 201203

LI Chengxin^,, WANG Xueping, CUI Feng^,, HAO Haijun

Instrumental Analysis & Research Center,Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry,China State Institute of Pharmaceutical Industry,Shanghai 201203,China

通信作者崔锋(1982-),男,山西太原人,助理研究员,学士,从事药品质量控制及质量标准研究。电话:021-20572000-1018,E-mail:cf2002sdu@hotmail.com。

作者简介李乘欣(1991-),女,湖北襄阳人,硕士,研究方向:药物分析。电话:021-20572000-1022,E-mail:13032131891@163.com。

中图分类号: R734.2;R927.2 文献标识码: B 文章编号: 1004-0781(2017)12-1398-04

摘要:

目的建立快速、准确的测定盐酸厄洛替尼含量的氢核磁共振定量分析方法。方法以马来酸为内标,DMSO-d6为溶剂,在测试温度为300 ℃,脉冲宽度9.54 μs,弛豫时间20 s和扫描次数为64次条件下测定氢核磁共振谱,通过比较马来酸内标峰与盐酸厄洛替尼定量峰面积,从而计算出盐酸厄洛替尼含量。结果马来酸δ 6.26处单峰信号作为内标峰,盐酸厄洛替尼δ 8.84和δ 8.47处作为定量峰,以两个定量峰面积的平均值计算盐酸厄洛替尼含量。盐酸厄洛替尼在2.88~19.08 mg·mL^-1浓度范围内与质子峰面积线性关系良好。精密度RSD为0.36%(n=6),重复性为0.83%(n=6),加样回收率为100.91%(n=6)。测得3批盐酸厄洛替尼含量含量分别为92.26%,91.94%和92.09%,平均含量为92.10%,RSD为0.17%。测定结果与质量平衡法定值结果基本一致。结论该方法操作简便、测定结果准确,为盐酸厄洛替尼的含量测定提供了新方法,适用于其原料药的质量控制。

关键词: 厄洛替尼 ; 盐酸 ; 核磁共振波谱法 ; 定量分析

Abstract:

Objective To establish a rapid and accurate method for quantitative determination of erlotinib hydrochloride by proton nuclear magnetic resonance (¹H-NMR). Methods Maleic acid was used as an internal standard,and DMSO-d6 was employed as solvent.The pulse width was 9.54 μs,the delay time was 20 s,the scanning frequency was 64 and the testing temperature was set as 300 ℃.Under this condition,the ¹H-NMR data of the mixture of erlotinib hydrochloride and maleic acid were obtained.The content of erlotinib hydrochloride was calculated by comparing the response signal area of sample (As) and internal standard (Ar). Results Proton signal peaked at δ 8.84 and δ 8.47 for erlotinib hydrochloride and at δ6.26 for maleic acid served as quantitation peaks.The content of erlotinib hydrochloride was obtained by calculating the average of the test results of the two quantitative peaks.The concentration of erlotinib hydrochloride (2.88~19.08 mg·mL^-1) and the peak area of quantification peaks showed a good linear correlation.The precision RSD was 0.36% (n=6),the repeatability RSD was 0.83% (n=6) and the sample recovery was 100.91% (n=6).The content of 3 batches of erlotinib hydrochloride was 92.26%,91.94% and 92.09%,the average was 92.10% and its RSD was 0.17%.The obtained results were generally consistent with those obtained from mass balance method. Conclusion This established method is simple to handle as compared to traditional methods,and the analysis results are accurate.¹H-NMR provides a novel method for the determination of erlotinib hydrochloride and can be used for the quality control of erlotinib hydrochloride.

Key words: Erlotinib ; hydrochloride ; Nuclear magnetic resonance ; Quantitative analysis

核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技术应用于定量分析的原理是化学环境不同的氢质子共振峰面积只与其氢原子个数相关,无需引入任何校正因子,于1963年开始用于定量分析^[1]。随着高强度磁场和傅里叶变换技术的应用,使得仪器的性能得到极大改善,从而进一步推动了NMR技术应用于定量分析领域。目前,中国、英国及美国等各国药典均已收载了氢核磁共振定量法(quantitative nuclear magnetic resonance, qNMR)。盐酸厄洛替尼(Erlotinib hydrochloride)化学名为N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺盐酸盐,是一种分子靶向治疗药物,通过抑制人体细胞内表皮生长因子上的一种特定酶活性从而达到抗肿瘤作用^[2-4]。其含量测定主要采用高效液相色谱法(HPLC)^[5-6],但国内目前尚无官方提供的盐酸厄洛替尼对照品。在合成盐酸厄洛替尼时难免会引入其他结构相似的杂质,使用质量平衡法测定盐酸厄洛替尼含量时,需要HPLC法对杂质进行有效分离,引入校正因子才能得出HPLC法含量,同时还需测定其水分、残留溶剂及炽灼残渣等。操作过程繁琐,耗时费力;而qNMR法测定样品含量时无需对照品,不受样品中水分、残留溶剂等干扰,操作过程简单,结构准确,因此与HPLC法相比具有较大的优势^[5]。本研究采用qNMR法对盐酸厄洛替尼样品含量进行了系统的方法学验证,为盐酸厄洛替尼原料药质量标准完善提供有力佐证,也为其对照品含量标定提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Bruker-400ADVENCE II型核磁共振仪(瑞士布鲁克公司);Topspin3.2试验控制及数据处理软件;高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司,型号:Agilent 1260);卡氏水分仪(瑞士万通中国有限公司,型号:915 KF Ti-touch);分析天平(德国Sartorius公司,感量:0.1 mg)。

1.2 试药

氘代DMSO(DMSO-d6,Sigma公司);盐酸厄洛替尼(江苏扬子江药业集团有限公司,HPLC色谱纯度:99.50%,批号:1512501);马来酸对照品(中国食品药品检定研究院,含量:99.7%,批号:190015-201302)。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液配制

精密称取马来酸对照品55.25 mg,溶于25 mL DMSO-d6中,作为内标溶液。精密称取盐酸厄洛替尼样品12.86 mg,加入1.0 mL马来酸内标溶液溶解、混匀。转移0.5 mL于5 mm核磁管中,作为供试品溶液。

2.2 实验条件

采用zg30脉冲序列测试¹H-NMR。实验参数设置为:温度为300 K,谱宽(SWH)8012 Hz,点数(TD)64 K,采样时间(AT)4.0 s,脉冲宽度9.54 μs,弛豫延迟时间(D1)20 s,采样次数(NS)64次。

2.3 HPLC色谱条件

色谱柱:Waters C₁₈(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-pH3.5磷酸盐缓冲液(20:80,v/v);流速1.0 mL·min^-1;检测波长343 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL^[6]。

2.4 测定方法的建立

2.4.1 盐酸厄洛替尼¹H-NMR谱图的归属盐酸厄洛替尼在CDCl3,CD3OD等溶剂中溶解度很差,但溶于DMSO-d6。因而最终选用DMSO-d6作为溶剂,且溶剂峰未与样品峰发生重叠。盐酸厄洛替尼¹H-NMR谱图及峰归属见图1。¹H-NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ 11.59(s,1H,-NH),8.84(s,1H,-Ar-H),8.47(s,1H,-Ar-H),7.89(t,H,-Ar-H),7.78~7.94(d,1H,-Ar-H),7.45~7.52(t,1H,-Ar-H),7.33~7.44(t,2H,-Ar-H),4.37~4.46(m,4H,-CH2×2),4.27(s,1H,-≡CH),3.87~3.70(m,4H,-CH2×2),3.33~3.41(dd,6H,-CH3×2),与文献报道一致^[7]。

2.4.2 专属性实验选用马来酸作为内标,与盐酸厄洛替尼混合物¹H-NMR谱图见图2。由图谱可知,马来酸内标峰归属为δ 6.26(s,DMSO-d6),具有易于识别的尖锐单峰,且未与样品峰发生重叠,不干扰盐酸厄洛替尼的谱峰,因而专属性较高。由于盐酸厄洛替尼δ 8.84(B2)和δ 8.47(B1)处都是一独立尖锐的单峰,完全与其他信号分离。因此,选择盐酸厄洛替尼B1和B2处单峰信号作为定量峰。

2.4.3 线性关系考察精密称取盐酸厄洛替尼样品2.88,4.95,7.78,14.24,19.08 mg,分别加入马来酸内标液1.0 mL溶解,混匀后,转移0.5 mL置5 mm核磁管中。以盐酸厄洛替尼的 δ8.84(B2)和δ 8.47(B1)定量峰的平均值与马来酸δ 6.26内标峰面积比(As/Ar, x)对盐酸厄洛替尼与马来酸质量比(ms/mr, y)作线性回归。线性回归方程为Y=2.994 2X-0.091 2(r=0.999 8)。因此盐酸厄洛替尼在2.88~19.08 mg·mL^-1浓度范围内与质子峰面积线性关系良好。

图1 盐酸厄洛替尼¹H-NMR谱图

Fig.1 ¹H-NMR spectrum of erlotinib hydrochloride

图2 马来酸与盐酸厄洛替尼¹H-NMR谱图
A.内标特征峰;B1和B2.盐酸厄洛替尼特征峰

Fig.2 ¹H-NMR spectrum of erlotinib hydrochloride and erlotinib maleic acid
A.characteristic peak of internal standard;B1 and B2.characteristic peak of erlotinib hydrochloride

2.4.4 精密度实验取“2.1”项下供试品溶液,按“2.2”项下条件连续进样测定6次,获取盐酸厄洛替尼与马来酸混合物的¹H-NMR图谱,积分5次取其平均值,计算定量峰与内标峰面积的比值。计算RSD为0.36%。

2.4.5 重复性实验按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液。按照“2.2”项下条件进样测定,获取盐酸厄洛替尼与马来酸混合物¹H-NMR图谱,积分5次取其平均值,计算定量峰与内标峰面积的比值。计算RSD为0.83%。

2.4.6 样品稳定性实验取“2.1”项下供试品溶液,分别于0,2,4,8,12 h进行测定,获取盐酸厄洛替尼与马来酸混合物¹H-NMR,积分5次取其平均值,计算定量峰与内标峰面积的比值。计算RSD为1.17%。

2.4.7 加样回收率实验取6份已知含量的盐酸厄洛替尼样品,分别加入相同量的盐酸厄洛替尼工作对照品(含量:97.43%),并加入内标溶液配制样品溶液,按照“2.2”项下的测试条件获取¹H-NMR,计算回收率。结果平均回收率为100.92%,RSD为1.74%。见表1。

取样量	样品量	加入量	测得量				回收率/ %
2.18	2.01	3.10	5.09	99.35
2.29	2.11	3.10	5.19	99.35
8.31	7.65	3.10	10.87	103.87
8.84	8.14	3.10	11.30	101.94
13.63	12.55	3.10	15.65	100.00
13.09	12.06	3.10	15.19	100.97

表1 盐酸厄洛替尼样品加样回收率实验

Tab.1 Recovery test of erlotinib hydrochloride

2.5 qNMR测试结果及其与质量平衡法结果的比较

精密称取3份盐酸厄洛替尼,按“2.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下测试条件进行测定,获取盐酸厄洛替尼与马来酸混合物¹H-NMR,以盐酸厄洛替尼δ8.84(B2)和δ 8.47(B1)处峰信号的平均值和δ 6.26处马来酸峰信号,按照如下公式计算盐酸厄洛替尼含量:

含量(%)= $\begin{matrix} \frac{(As / ns) \times Ms \times mr}{(Ar / nr) \times Mr \times ms} \end{matrix}$ ×Wr×100%

式中 As为盐酸厄洛替尼定量峰积分面积的平均值,ns为盐酸厄洛替尼定量峰代表的氢个数,Ms为盐酸厄洛替尼分子量,Ar为马来酸定量峰的积分面积,nr为马来酸定量峰代表的氢个数,Mr为马来酸分子量,mr为马来酸质量,Wr为马来酸百分含量,ms为盐酸厄洛替尼质量。

经计算,3份盐酸厄洛替尼含量分别为92.26%,91.94%和92.09%,平均含量为92.10%,RSD为0.17%。

采用HPLC面积归一化法测定盐酸厄洛替尼色谱纯度为99.46%,干燥失重法测定样品含水量为7.25%,炽灼残渣结果为0.07%。根据质量平衡法计算,盐酸厄洛替尼(%)=(100%-水分%-炽灼残渣%)×HPLC纯度=92.17%^[8]。

3 讨论

在确定弛豫时间,采样次数等重要的仪器参数时,尽管Ax/As的比值变化趋势不同,但不论何种变化趋势,各个仪器参数应取Ax/As比值趋于稳定时的初始值。不但保证了测定结果的准确性,还可大大缩短分析时间,提高效率^[8-9]。由于弛豫机制的不同,导致不同类型的氢质子恢复Boltzmann平衡程度不尽相同,所以选择类型一致的氢质子可以保证积分结果的一致性和准确性^[10]。马来酸δ 6.26处内标峰属于烯键氢,盐酸厄洛替尼δ 8.84(B2)和δ 8.47(B1)的质子峰也属于都烯键氢,且基线平坦,峰型简单,专属性高,因此都适合作为定量峰,并以两个定量峰测试结果的平均值计算盐酸厄洛替尼含量。定量峰选择的是芳环上的氢质子,但杂质芳环附近基团的变化都会引起定量峰位置上氢质子化学环境的改变,导致化学位移也随之改变,所以测定不受杂质干扰。水峰的化学位移在δ5.0,所以不会影响定量峰。残留溶剂除氘代吡啶外,都不干扰定量峰,但厄洛替尼的合成过程未用到吡啶^[11-12]。¹H-NMR测定盐酸厄洛替尼含量,无需对照品,消耗的样品量很少,测试过程简单,结果可靠。可作为质量平衡法的有效补充,也为盐酸厄洛替尼原料药、对照品及制剂含量测定提供有价值的参考。

采用qNMR定量也有一定的限制:待测化合物的结构必须已知才能正确定量;无法区分结构非常接近的类似物,定量峰必须与其他信号完全分离,才能准确定量;不适用于浓度极低的样品,这与qNMR灵敏度不高有关。但随着核磁共振技术的进一步发展,必然会推动qNMR技术被越来越多的学者所青睐,迎来更为广阔的应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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2014

... 采用HPLC面积归一化法测定盐酸厄洛替尼色谱纯度为99.46%,干燥失重法测定样品含水量为7.25%,炽灼残渣结果为0.07%.根据质量平衡法计算,盐酸厄洛替尼(%)=(100%-水分%-炽灼残渣%)×HPLC纯度=92.17%^[8]. ...

... 在确定弛豫时间,采样次数等重要的仪器参数时,尽管Ax/As的比值变化趋势不同,但不论何种变化趋势,各个仪器参数应取Ax/As比值趋于稳定时的初始值.不但保证了测定结果的准确性,还可大大缩短分析时间,提高效率^[8-9].由于弛豫机制的不同,导致不同类型的氢质子恢复Boltzmann平衡程度不尽相同,所以选择类型一致的氢质子可以保证积分结果的一致性和准确性^[10].马来酸δ 6.26处内标峰属于烯键氢,盐酸厄洛替尼δ 8.84(B2)和δ 8.47(B1)的质子峰也属于都烯键氢,且基线平坦,峰型简单,专属性高,因此都适合作为定量峰,并以两个定量峰测试结果的平均值计算盐酸厄洛替尼含量.定量峰选择的是芳环上的氢质子,但杂质芳环附近基团的变化都会引起定量峰位置上氢质子化学环境的改变,导致化学位移也随之改变,所以测定不受杂质干扰.水峰的化学位移在δ5.0,所以不会影响定量峰.残留溶剂除氘代吡啶外,都不干扰定量峰,但厄洛替尼的合成过程未用到吡啶^[11-12].¹H-NMR测定盐酸厄洛替尼含量,无需对照品,消耗的样品量很少,测试过程简单,结果可靠.可作为质量平衡法的有效补充,也为盐酸厄洛替尼原料药、对照品及制剂含量测定提供有价值的参考. ...

核磁共振波谱法测定藁本内酯对照品的含量

2010

A simple and specific quanti-tative method for determination of dictamnine in Dictamni Cortex by H NMR spectroscopy

2013

厄洛替尼的合成工艺改进

2014

厄洛替尼合成工艺改进

2012