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医药导报
医药导报, 2017, 36(2): 127-131
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2017.02.003
7,4’-二羟基黄酮在Caco-2细胞模型中的代谢及转运*
Metabolism and Transport of 7,4’- dihydroxyflavone in Caco-2 Cell Model
马颖林, 周一平, 周昱, 蒋昆谕, 孟胜男
中国医科大学药学院药剂教研室,沈阳 110122
MA Yinglin,, ZHOU Yiping, ZHOU Yu, JIANG Kunyu, MENG Shengnan,
Pharmaceutical Staff Room, School of Pharmacy, Chinese Medical University, Shenyang 110122, China

作者简介 马颖林(1990-),女,山西临汾人,在读硕士,主要从事黄酮类化合物Ⅱ相代谢的研究。电话:18704032935,E-mail:ylmacmu@163.com。

通信作者 孟胜男(1966-),女,辽宁沈阳人,教授,博士,主要从事药物吸收和代谢特征的评价、药动学、药物新剂型的研究。电话:024-23256666,E-mail:shnmeng_16@163.com。
基金资助: *国家自然科学基金资助项目(81173123)
中图分类号: R965     文献标识码: A     文章编号: 1004-0781(2017)02-0127-05
摘要: 目的研究不同转运体对7,4’-二羟基黄酮(7,4’-DHF)及其代谢产物(7,4’-DHF-S)在Caco-2细胞模型中转运的影响。方法采用超高效液相色谱法测定Caco-2细胞孵育液中7,4’-DHF及7,4’-DHF-S的含量,采用液相色谱-质谱串联(LC-MS/MS)鉴定其结构。采用Caco-2细胞模型双向转运实验分别考察乳腺癌耐药蛋白(BCRP)抑制剂ko143和多药耐药相关蛋白2(MRP2)抑制剂MK571对7,4’-DHF及7,4’-DHF-S表观渗透率(PDR)的影响。结果7,4’-DHF可被Caco-2细胞代谢产生单磺酸化结合产物; 7,4’-DHF的PDR 为(1.43±0.11),ko143和MK571对7,4’-DHF的PDR分别为(1.59±0.04),(1.48±0.07),差异无统计学意义(P>0.05);7,4’-DHF-S的PDR为(1.60±0.06),ko143可显著降低7,4’-DHF-S的PDR(0.23±0.03)(P<0.01),MK571对7,4’-DHF-S的PDR无显著影响,为(1.51±0.04)(P>0.05)。结论Caco-2细胞可介导7,4’-DHF的磺酸化代谢反应,7,4’-DHF-S可能是BCRP的底物。
关键词: 7,4’ ; -二羟基黄酮 ; Caco-2单层细胞模型 ; 多药耐药相关蛋白2 ; 乳腺癌耐药蛋白

Abstract:
ObjectiveTo study the effects of different transport protein on the transport of 7,4’-dihydroxyflavone (7,4’-DHF) and its metabolite(7,4’-DHF-S) in Caco-2 cell model. MethodsUltra performance liquid chromatography was employed to determinethe content of 7,4’-DHF and 7,4’-DHF-S incubation buffer, their structures were identified by LC-MS/MS. Bidirectional transport of Caco-2 cells model was used to investigate the influence of ko143(the inhibitor of BCRP) and MK571(the inhibitor of MRP2) on the transport of 7,4’-DHF and 7,4’-DHF-S,respectively. ResultsMetabolic product of 7,4’-DHF in Caco-2 monolayer cell was identified as one monosulfate; PDR of 7,4’-DHF was (1.43±0.11), PDR of ko143 and MK571 on the apparent permeability of 7,4’-DHF was(1.59±0.04) and (1.48±0.07) (P>0.05); PDR of 7,4’-DHF-S was (1.60±0.06);ko143 could significantly reduce the apparent permeability of 7,4’-DHF-S, and the PDR was (0.23±0.03) (P<0.01);MK571 had no significant effect on the apparent permeability of the 7,4’-DHF-S, and the PDR was (1.51±0.04) (P>0.05). ConclusionCaco-2 cells can mediate the sulfonated reaction of 7,4’-DHF; 7,4’-dihydroxyflavone sulfonated combination product may be a substrate for BCRP.
Key words: 7,4’ ; -dihydroxyflavone ; Caco-2 cell monolayer model ; Multidrug resistance-associated protein 2 ; Breast cancer resistance protein

7,4’-二羟基黄酮(7,4’-dihydroxyflavone, 7,4’-DHF)是一类具有活血化瘀、镇痛抗炎[1]、抗氧化[2],抗真菌[3]等多种药理作用的黄酮类化合物。LEE等[4]报道,甘草素进入人体后大部分在肝脏内被代谢为7,4’-DHF,但并没有发挥其生物活性,后期发现7,4’-DHF只在尿液和排泄物中检测到少许,而血浆中检测不到,推断其通过Ⅱ相代谢被排出体外。另外有研究证实,黄酮类化合物口服生物利用度低,主要是因为其在肠道中首过代谢[5],小肠上皮细胞对黄酮类化合物强烈的Ⅱ相代谢反应(主要是葡萄糖醛酸化和磺酸化代谢反应[6])及对Ⅱ相代谢产物的排泄导致其吸收减少,目前关于黄酮类化合物的Ⅱ相代谢反应已有不少研究,而对于其Ⅱ相代谢产物在肠道内排泄的相关研究笔者尚未发现国内报道。Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞,体外培养可形成与小肠上皮细胞结构相似的微绒毛和紧密连接[7],并可表达多种转运体[8],是目前国内外公认的研究药物吸收、代谢和跨膜转运机制最为成熟的体外模型[9]。故本研究应用Caco-2细胞模型来考察不同转运体抑制剂对7,4’-DHF及其Ⅱ相代谢产物转运的影响,以进一步探究转运体对黄酮类化合物肠道吸收的影响,从而为提高黄酮类化合物的生物利用度,促进其临床应用提供一定的理论指导。

1 材料与方法
1.1 仪器

UPLC- Waters, Waters® 2996 PDA 检测器(美国Waters公司);API 3200Q Trap 三重四极杆质谱(Applied Biosystem/MDS SCIEX, FosterCity, CA);TLL-C高速冷冻离心机(北京四环科学仪器厂); AL104分析天平(梅特勒-托利多公司,感量:0.1 mg)、320pH计(梅特勒-托利多公司);涡旋混合器(北京金紫光科技发展有限公司);Millicell-ERS型跨膜电阻仪(美国Millipore公司);二氧化碳(CO2)培养箱(力申科学仪器有限公司);CKX31SF倒置显微镜(日本Olympus公司);细胞培养板和插入式培养皿(美国Corning公司)。

1.2 试药

高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM),胎牛血清(FBS,美国Gibco公司,批号:20140928);胰酶(美国Invitrogen公司,批号:2014021133);非必需氨基酸(美国Hyclone公司,批号:A2J193442);青-链霉素双抗溶液(美国Hyclone公司,批号:SV30010);7,4’-DHF,MK571,ko143(美国Sigma公司,含量>98%);乙腈(色谱纯,天津康科德公司);其他试剂为分析纯,超纯水。

1.3 细胞的培养

Caco-2 TC7 细胞培养于含10% FBS,1%非必需氨基酸,0.1%青霉素和链霉素双抗液的DMEM高糖培养液中,并置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。隔天换培养液,当细胞融合达到90%~95%时,胰酶消化,将细胞混悬液以2×105个·mL-1种植于Transwell培养板上的Insert(孔径0.4 μm,面积 4.67 cm2)中,接种后隔天换液,细胞培养21 d,测其跨膜电阻,当细胞单层电阻值>420 Ω·(cm2)-1时,说明细胞分化完全并形成致密的细胞层,可进行药物转运试验。

1.4 药物的跨膜转运实验

实验前先用37 ℃,pH值7.4的Hamk'平衡盐溶液(Hamk's balanced salt solution,HBSS)溶液清洗细胞单层2次,在Insert内外两侧均加入HBSS溶液3 mL,并测定其跨膜电阻,如果符合试验要求,置于摇床中孵育30 min,吸弃HBSS溶液。药物从绒毛面(apical,AP)侧至基底面(basolateral, BL)侧的转运:在AP侧加入药物溶液1.5 mL作为供给池,BL侧加入空白液2.6 mL作为接收池;药物从BL侧至AP侧的转运:在BL侧加入药物溶液2.6 mL作为供给池,AP侧加入空白液1.5 mL作为接收池。将加完液体的Transwell培养板置于37 ℃转速为50 r·min-1的摇床上,于0,30,60,90,120 min分别在AP,BL侧采样0.3 mL,同时补充同体积相同液体,试验平行3份。

1.5 样品分析

UPLC色谱条件:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流动相A:100%乙腈,流动相B:2.5 mmol·L-1醋酸铵缓冲盐溶液(pH值4.5);梯度洗脱:0~1.5 min,10%→30%A;~2.5 min,30%→40%A;~3 min,40%→60%A;~3.5 min,60%→90%A;~4 min,90%→10%A;~5.5 min,10%A;内标:睾酮;进样量:10 μL;流速:0.25 mL·min-1;本实验采用双通道紫外检测波长:240 nm(内标)和340 nm(7,4’-DHF及其代谢产物)。柱温:35 ℃。

质谱条件: 负离子方式检测;离子喷雾电压:-4.0 kV;源温度:400 ℃;喷雾气(gas l):氮气,40 psi(275.8 kPa); 涡轮气(gas 2):氢气,20 psi(137.9 kPa);保护气:氮气,20 psi(137.9 kPa)。采用一级全扫描质谱及选择离子全扫描二级质谱两种方式同时测定。

1.6 数据处理

药物在Caco-2细胞单层的表观渗透系数(Papp)=(dQ/dt)/(A·Co),其中dQ/dt表示单位时间药物转运量(nmol·s-1);A表示转运膜面积,本实验为4.2 cm2;Co为7,4’-DHF初始浓度(μmol·L-1);药物累计通过量TRcum=An+ V S n V R ∑ i = 0 n - 1 Ai,其中An为第n个样品通过量的测定值(nmol),VSn为第n个样品的采样体积(mL),VR为接收池体积(mL);药物的表观渗透率(PDR)=PB-A/PA-B,其中PB-A为药物从BL侧到AP侧的表观渗透系数,PA-B为药物从AP侧到BL侧的表观渗透系数。

1.7 统计学方法

采用SPSS16.0版统计软件进行统计分析。所有数据点均为三次测定的平均值,结果以均数±标准差( x ̅ ±s)表示。组内各项指标进行均数方差分析,即进行F检验,两组间均数比较采用单因素t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 7,4’-DHF及其代谢产物分析方法的建立和定量

7,4’-DHF在Caco-2单层细胞孵育后产生一种磺酸化代谢产物(7,4’-dihydroxyflavone sulfonated combination product, 7,4’-DHF-S),在本实验条件下,7,4’-DHF,7,4’-DHF-S及内标峰形良好,无杂质干扰,7,4’-DHF的tR为3.258 min,7,4’-DHF-S的tR为2.732 min,见图1。7,4’-DHF的标准曲线方程为Y=0.092 8X-0.006,R2 = 0.999 8,浓度范围0.625~ 40 μmol·L-1。由于无市售7,4’-DHF-S,因此在本研究中基于7,4’-DHF的标准曲线,确定两者之间的转换因子(K),从而对其磺酸化结合产物进行定量,测得的转化因子K值为1.041。


图1 7,4’-二羟基黄酮的空白对照及细胞样品UPLC 色谱图 A.空白对照液;B.样品溶液;1. 7,4’-DHF; 2. 7,4’-DHF-S

Fig.1 UPLC chromatogram of 7,4’-dihydroxyflavone in blank samples and cell samples A.blank control solution;B.sample solution;1. 7,4’-dihydroxyflavone; 2.7,4’-dihydroxyflavone metabolite

2.2 LC-MS/MS鉴定7,4’-二羟基黄酮的代谢产物

本实验采用LC-MS/MS 技术进一步鉴定7,4’-DHF及其代谢产物。结果显示,样品产生的准分子离子峰[M-H]-m/z 为332.9,与7,4’-DHF的磺酸基结合产物的相对分子质量(334.2)相吻合。另一分子离子峰m/z为253.0与准分子离子峰[M-H]-m/z相差80,推断其为[M-SO3]-,即丢失1个磺酸基碎片所得。由此确认代谢产物即为磺酸基结合产物(图2)。


图2 7,4’-二羟基黄酮及其代谢产物的LC-MS/MS 图谱

Fig.1 LC-MS/ MS spectra of 7,4’- dihydroxyflavone and its metabolite

2.3 跨膜转运实验

2.3.1 细胞模型的验证 测定Caco-2细胞单层的TEER值均>420 Ω·(cm2)-1,表明Caco-2细胞生长分化形成了致密的单层结构,其致密性和转运功能良好。

2.3.2 MRP2抑制剂MK571对7,4’-DHF及其代谢产物跨膜转运的影响 在37 ℃,pH值=7.4的HBSS中,7,4’-DHF及其代谢产物从AP侧至BL侧(吸收)及从BL侧至AP侧(外排)的转运量随时间变化的情况见图3,结果显示,7,4’-DHF及其代谢产物的外排大于吸收,MK571对两者的吸收和外排均没有显著影响。


图3 MK571对7,4’-DHF及其代谢产物跨膜转运的影响 A. 7,4’-DHF; B. 7,4’-DHF-S

Fig.3 Influence of MK571 on transmembrane transport of 7,4’-dihydroxyflavone and its metabolite A. 7,4’-dihydroxyflavone;B. 7,4’-dihydroxyflavone metabolite

2.3.3 BCRP抑制剂ko143对7,4’-DHF及其代谢产物跨膜转运的影响 在37 ℃,pH值7.4的HBSS中,7,4’-DHF及其代谢产物吸收及外排的转运量随时间变化的情况见图4,结果显示,7,4’-DHF及其代谢产物的外排大于吸收,ko143可降低7,4’-DHF吸收,但对外排没有影响;ko143可显著降低代谢产物的外排,增加其吸收。


图4 ko143对7,4’-二羟基黄酮及其代谢产物跨膜转运的影响 A. 7,4’-DHF; B. 7,4’-DHF-S

Fig.4 Influence of ko143 on transmembrane transport of 7,4’-dihydroxyflavone and its metabolite A. 7,4’-dihydroxyflavone;B. 7,4’-dihydroxyflavone metabolite

2.3.4 加抑制剂前后7,4’-DHF及其代谢产物的Papp及PDR的变化情况 以10 μmol·L-1的7,4’-DHF孵育生长在Transwell板上的Caco-2单层细胞,分别加入ko143和MK571,计算加抑制剂前后7,4’-DHF及其代谢产物的Papp及PDR。7,4’-DHF的Papp及PDR的变化见表1,7,4’-DHF代谢产物的Papp及PDR的变化见表2。

表1 抑制剂对7,4’-DHF的 Papp及PDR的影响
Tab.1 Influence of the inhibitor on Papp and PDR of 7,4’-dihydroxyflavon x¯±s,n=3
项目 PA-B PB-A PDR
(×10-6 cm·s-1)
7,4’-DHF 9.06±0.14 12.98±0.15 1.43±0.11
7,4’-DHF+ko143 8.21±0.09 13.04±0.08 1.59±0.04*1
7,4’-DHF+MK571 8.14±0.11 12.08±0.14 1.48±0.07*2
F - - 0.57
P - - 0.59

Compared with 7,4’-DHF,t=2.37,*1P=0.08;t=0.66,*2P=0.54

与7,4’-DHF比较,t=2.37,*1P=0.08;t=0.66,*2P =0.54

表1 抑制剂对7,4’-DHF的 Papp及PDR的影响

Tab.1 Influence of the inhibitor on Papp and PDR of 7,4’-dihydroxyflavon x¯±s,n=3

表2 抑制剂对7,4’-DHF代谢产物的Papp及PDR的影响
Tab.2 Influence of the inhibitor on Papp and PDR of 7,4’-dihydroxyflavone metabolite x¯±s,n=3
项目 PA-B PB-A PDR
(×10-6 cm·s-1)
7,4’-DHF-S 6.72±0.18 10.78±0.17 1.60±0.06
7,4’-DHF-S+ko143 10.54±0.05 2.47±0.08 0.23±0.03*1
7,4’-DHF-S+MK571 8.69±0.09 13.14±0.15 1.51±0.04*2
F - - 212.25
P - - 0.00

与7,4’-DHF-S比较,t=35.37,*1P=0.00;t=2.16,*2P =0.10 Compared with 7,4’-DHF-S,t=35.37,*1P=0.00;t=2.16,*2P =0.10

表2 抑制剂对7,4’-DHF代谢产物的Papp及PDR的影响

Tab.2 Influence of the inhibitor on Papp and PDR of 7,4’-dihydroxyflavone metabolite x¯±s,n=3

3 讨论

磺酸化代谢反应是磺基转移酶催化将3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸提供的磺酸基团与底物的酚羟基结合生成硫酸酯类复合物,从而增强底物亲水性,使底物更易排出体外[10]。磺酸化代谢反应是内源性和外源性化合物在体内进行Ⅱ相代谢的主要途径之一,其在药物的代谢和解毒方面发挥极其重要的作用[11]。目前关于7,4’-DHF的磺酸化代谢反应,笔者在国内尚未见详细报道,对其在肠道的吸收和代谢方面的文献研究也并不深入,因此在本实验中研究7,4’-DHF的磺酸化代谢反应及其代谢产物的外排效应。

在本研究中,笔者用LC-MS/MS鉴定7,4’-DHF经Caco-2细胞单层孵育后的代谢产物为单磺酸基结合产物,确定Caco-2细胞可介导7,4’-DHF的磺酸化代谢反应。之后应用Caco-2单层细胞模型研究不同转运体抑制剂对7,4’-DHF及其代谢产物双向转运的影响,结果显示,7,4’-DHF的PDR<1.5,而其代谢产物PDR>1.5,提示7,4’-DHF的主要转运机制为被动转运,而其代谢产物涉及主动转运机制。MRP2抑制剂MK571对7,4’-DHF及其磺酸化代谢产物的吸收和外排均没有显著影响,推测7,4’-DHF代谢产物的主动转运机制不涉及MRP2。BCRP抑制剂ko143可降低7,4’-DHF吸收,对外排没有影响,但其Papp和PDR的变化均差异无统计学意义,猜测可能是外排转运体虽对7,4’-DHF的转运存在影响,但相对于大量被动转运来说,影响较小;然而ko143显著增加7,4’-DHF代谢产物的吸收,减少其外排,显著降低其PDR(P<0.01),提示BCRP特异性抑制剂可显著抑制BCRP对7,4’-DHF代谢产物的外排效应,由此推测7,4’-DHF磺酸化代谢产物有可能是BCRP的底物,后续将会进一步通过动物实验来验证。

总之,实验结果显示BCRP参与7,4’-DHF磺酸化代谢产物在肠道中外排,可能是造成7,4’-DHF生物利用度较低的原因之一,至于是否还存在其他外排蛋白参与其中仍有待继续研究。另外,本实验通过抑制转运体对药物的外排来增加其吸收,也为提高黄酮类化合物生物利用度的研究提供一种新思路。

The authors have declared that no competing interests exist.
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马颖林
周一平
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孟胜男
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