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医药导报, 2017, 36(2): 162-166
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2017.02.011
五味子甲素对P-糖蛋白抑制作用的体内外研究*
Inhibitory Effects of Deoxyschizandrin on P-glycoprotein in Vitro and in Vivo
李维亮1,, 宋建军2, 辛华雯1,

摘要: 目的研究五味子甲素对P-糖蛋白(P-gp)的影响。方法选用Caco-2细胞模型体外研究P-gp对不同浓度五味子甲素(20,40,80 μg·mL-1)转运的影响,同时测定五味子甲素(20~160 μg·mL-1)对P-gp底物——罗丹明123和环孢素A表观渗透系数(Papp)的影响。40只雄性SD大鼠随机分为5组:空白对照组、维拉帕米组、五味子甲素小、中、大剂量组。五味子甲素小、中、大剂量组每日分别灌胃给予五味子甲素 8,16,32 mg·kg-1,维拉帕米组给予维拉帕米4 mg·kg-1,空白对照组给予等体积纯化水。连续给药3 d,每日1次。最后一次给药30 min后立即灌胃给予5 mg·kg-1的罗丹明123,测定罗丹明123药动学特征,体内评价五味子甲素对P-gp的效应。结果P-gp对20,40,80 μg·mL-1五味子甲素的双向转运无选择差异;五味子甲素(20~160 μg·mL-1)可显著抑制罗丹明123和环孢素A在Caco-2细胞模型中基底面→顶面(BL→AP)定向转运速率(P< 0.05),且呈剂量相关性;五味子甲素(8~32 mg·kg-1)可剂量依赖性降低大鼠血浆罗丹明123峰浓度(Cmax)和血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC0-t)。结论五味子甲素在体内外均可显著抑制P-gp,但不是P-gp底物。
关键词: 五味子甲素 ; P-糖蛋白 ; Caco-2细胞模型 ; 药动学 ; 罗丹明123 ; 环孢素A

Abstract:
ObjectiveTo investigate the influence of deoxyschizandrin (Deo) on P-glycoprotein (P-gp). MethodsThe effect of P-gp on Deo (20, 40, 80 μg·mL-1) was studied in the Caco-2 cell model in vitro, and the apparent permeability coefficient (Papp) of Deo (20-160 μg·mL-1) on a P-gp substrate, rhodamine123 or cyclosporine A, was calculated. Healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups: blank control group, verapamil group, low-, medium- and high- dose Deo group (8 rats in each group). Rats in the low-,medium- and high-dose Deo group were intragastrically administered once daily with Deo at 8, 16 and 32 mg·kg-1 for 3 consecutive days, while rats similarly received gavagewith verapamil (4 mg·kg-1) in the verapamil group and equal volume of purified water in the blank control group. Thirty minutes after the rats were treated with their respective drugs, rhodamine123 (5 mg·kg-1) was orally administrated.Then the pharmacokinetic profiles of rhodamine 123 were analyzed to evaluate the inhibitory ability of Deo on P-gp in vivo. ResultsThe bidirectional transport rates of Deo (20, 40, 80 μg·mL-1) were similar, with non-selectivity. Deo (20-160 μg·mL-1) significantly inhibited the basolateral→apical(BL→AP) directional transports of rhodamine 123 and cyclosporine A in Caco-2 cell model (P<0.05) in a concentration-dependent manner. And Deo (8-32 mg·kg-1) also dose-dependently decreased the peak concentrations (Cmax) and the area under the plasma concentration-time curve (AUC0-t) of Rho123. ConclusionDeo can inhibit P-gp in vitro and in vivo, but it is not a P-gp substrate.
Key words: Deoxyschizandrin ; P-glycoprotein ; Caco-2 cell model ; Pharmacokinetics ; Rhodamine123 ; Cyclosporine A

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一种跨膜转运蛋白,广泛分布于人体具有分泌、排泄作用的内皮细胞的表面,如肠、肝、肾以及血-脑屏障和胎盘屏障的上皮细胞,它能主动将细胞内药物逆向泵出细胞,降低药物浓度,减少药物吸收和生物利用度,甚至导致耐药[1-2]。P-gp外排药物(底物)在临床上十分常见, P-gp抑制药可减少药物外排,改善其生物利用度。近年来被临床用于提高化疗药物杀伤肿瘤细胞的疗效或减少免疫抑制药的用量降低药费。五味子甲素(deoxyschizandrin,Deo)是中药五味子重要的活性成分,其结构母核——联苯双酯可能是抑制P-gp的有效部位[3-4] 。笔者在本研究拟采用目前研究外源性化合物肠道吸收特性较理想的体外模型——Caco-2细胞模型,以P-gp底物罗丹明123 (rodamine 123, Rho123)和环孢素(cyclosporine A, CsA)为对象研究P-gp与Deo的相互作用;采用P-gp探针药——Rho123研究Deo在体内对P-gp底物的药动学影响。

1 材料与方法
1.1 实验动物

无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠,体质量(250±30) g,由武汉大学动物实验中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(鄂)2008-0005。饲养于经检验合格的本院动物实验中心SPF洁净级环境中,温度20~24 ℃,相对湿度55%~65%。自由进食,每周更换垫料3次,实验动物使用许可证号SYXK(鄂)2008-0007。

1.2 药品与试剂

人结肠癌细胞株Caco-2细胞购自中国科学院上海细胞库;TranswellTM多聚碳酸酯膜(直径12 mm,孔径0.4 μm)购自美国Costar公司;Deo(含量>98%,批号:120907)购于上海融禾医药科技发展有限公司;罗丹明123(批号:12/13)购自美国Sigma公司;[medmt-β-3H]环孢素([3H]CsA,9 Ci·mmol-1,批号:TEL1011) 购自英国Amersham Biosciences公司;达尔伯克改良伊格尔培养基(Dullecco's modified Eagle's medium,DMEM)(高糖)、胰酶、非必需氨基酸购自美国 Hyclone 公司;胎牛血清购自杭州四季青有限公司;甲醇(色谱醇)等化学试剂购自上海国药化学试剂有限公司;其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

Agilent 1100 高效液相色谱仪(包括G1311A型四元泵,G1313A型自动进样器,G1316A型柱温箱,G1314A型紫外检测器,Agilent色谱工作站);美国NEN 2000CA型液体闪烁计数仪。

1.4 细胞实验

1.4.1 细胞培养和转运模型建立 将 Caco-2 细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM 培养基中(包括1%非必需氨基酸、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素),置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中。取对数生长期的 Caco-2细胞(30~40代),以每皿2×105 个密度种于Transwell多聚碳酸酯膜上,培养14~21 d,以无血清培养基Optimen 替换Transwell内外侧培养基,测定跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEEM),电阻经空白校正后> 300 Ω·cm2 的细胞模型方可用于跨膜转运实验。实验前,将细胞模型在Optimem溶液中平衡30 min,实验后需测定跨膜电阻,保证在实验过程中TEEM>300 Ω。所有实验重复至少3次。

1.4.2 P-糖蛋白对Deo跨膜转运的影响 Hank's平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution,HBSS)缓冲液(37 ℃)轻洗Transwell膜2次后,在Transwell膜的基底面(basolateral,BL) 或顶面(apical,AP)加入Optimen稀释的Deo (20,40或80 μg·mL-1) 800 μL,另一侧加入Optimen 800 μL。分别于1,2,3,4 h 在Transwell对侧(仅加Optimen侧)取样品100 μL,并以Optimen补足损失体积。

1.4.3 Deo对P-gp底物跨膜转运的影响 选用Rho123和CsA进行实验,不同浓度Deo(10,20,40,80或160 μg·mL-1)与Rho123 (4 μg·mL-1)或CsA(5 μmol·L-1,含0.5‰[3H]CsA)共同加入Transwell膜的一侧,另一侧加入800 μL的 Optimen,取样方法同前。

1.5 动物实验

将40只雄性SD大鼠于实验中心适应性喂养1周后,随机分为5组:Deo小、中、大剂量组,维拉帕米组和空白对照组。Deo小、中、大剂量组每日分别灌胃给予Deo 8,16,32 mg·kg-1,维拉帕米组灌胃给予维拉帕米4 mg·kg-1,空白对照组给予同体积纯化水。连续给药2 d后,第2天晚上开始禁食24 h,不禁水。实验前第3次灌胃给药30 min后灌胃给予Rho123,剂量为5 mg·kg-1,分别于给药前和给药后5,10,20,30,60,90 min及3,6,9,12,18,24,36,48 h,给大鼠尾静脉采血250 μL,置于1 mL肝素化抗凝EP管中。分离血浆,于-40 ℃冷藏。采血间隔期间大鼠自由饮水。

1.6 样品处理

“1.4.2”项下所取样品100 μL与甲醇100 μL充分混合后,高效液相色谱(HPLC)法测定Deo含量。“1.4.3”项下所取样品100 μL与HBSS缓冲液120 μL充分混合后,HPLC法测定Rho123含量;样品50 μL与液闪液1 000 μL充分混合后,液闪仪测定[3H]CsA放射活性,计算CsA含量。“1.5”项下所取样品150 μL与乙腈180 μL充分振荡5 min,待充分形成絮状沉淀后, 7 160×g离心5 min,HPLC分析上清液Rho123浓度。

1.6 色谱条件

1.6.1 Deo浓度测定的色谱条件 大连依利特BDS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);甲醇-4%醋酸水溶液(80∶20)为流动相;紫外检测波长为254 nm;流速为1 mL·min-1;柱温为40 ℃;进样量为20 μL。

1.6.2 Rho123浓度测定的色谱条件 大连依利特BDS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);乙腈-0.20 mmol·L-1磷酸氢钾缓冲溶液(pH值=4.0)(60∶40)为流动相;荧光检测器(激发波长485 nm、发射波长546 nm);流速为1 mL·min-1; 柱温为25 ℃;细胞样品进样量为20 μL,血浆样品进样量为50 μL[5]

1.7 数据计算

细胞实验的表观渗透系数(apparent permeability coefficient,Papp)以下列公式计算:Papp=dQ/(dt·A·C0)。其中dQ/dt(μg·s-1)指单位时间药物转运量,A(cm2)表示转运膜表面积,C0 (μg·mL-1)指药物在单侧的初始浓度。测定基底面→顶面(BL→AP)和顶面→基底面(AP→BL)的Papp,表观渗透率(permeability directional ratio, PDR)以下列公式计算:PDR=PappBL→AP/ P appAP BL 6

1.8 统计学方法

采用SPSS10.0版统计软件进行方差分析。计量资料以均数±标准差( x ̅ ±s)表示,大鼠血浆样品采用DAS 2.0药动学计算软件分析各组血药浓度随时间的变化,计算其动力学参数。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 P-gp对Deo跨膜转运的影响

采用噻唑蓝(MTT)法观察药物对Caco-2细胞模型的毒性,结果表明本实验所用到的药物浓度对细胞模型均无毒性,不影响细胞膜的通透性。Deo的Papp随药物浓度增加而递减,但浓度间差异无统计学意义,3个浓度(20,40,80 μg·mL-1)的PDR值均约为1(表1),表明P-gp对Deo的双向跨膜转运无选择性差异,提示Deo不是P-gp底物。不同浓度Deo的Papp均>1×10-6 cm·s-1,表明Deo在体内吸收情况良好。

表1 不同浓度Deo表观渗透系数及表观渗透率
Tab.1 Papp and PDR of different concentration of Deon=3
Deo浓度/
(μg·mL-1)
Papp/(×10-6 cm·s-1) PDR
BL→AP AP→BL
20 5.65±0.09 6.05±0.09 0.93
40 3.66±0.23 3.66±0.57 1.00
80 2.00±0.03 2.17±0.04 0.92

表1 不同浓度Deo表观渗透系数及表观渗透率

Tab.1 Papp and PDR of different concentration of Deon=3

2.2 Deo对P-gp底物跨膜转运的影响

结果见表2,3。20~160 μg·mL-1Deo可显著抑制Rho123及CsA在Caco-2细胞模型中BL→AP定向转运率速率(P<0.05),且呈剂量相关性。在不同情况下,CsA和Rho123的PDR值均>2,显示P-gp特异性底物的转运特征——对双向转运速率的选择性差异。

表2 不同浓度Deo对Rho123在Caco-2细胞模型中双向跨膜转运的影响
Tab.2 Influence of different concentration of Deo on bidirectional transmembrane transport of Rho123 in Caco-2 cell modeln=3
Deo浓度/
(μg·mL-1)
Papp/(×10-6 cm·s-1) PDR
BL→AP AP→BL
Rho123 14.29±0.96 1.20±0.75 11.91
Rho123+Deo
10 13.84±0.65 1.95±1.29 7.10
20 12.71±0.49*1 1.94±0.41 6.55
40 11.42±0.48*2 2.01±0.60 5.68
80 10.33±0.27*2 1.52±0.66 6.80
160 10.05±0.27*2 1.50±0.62 6.70

Compared with Rho123, *1P<0.05,*2 P<0.01

与Rho123比较,*1P<0.05,*2 P<0.01

表2 不同浓度Deo对Rho123在Caco-2细胞模型中双向跨膜转运的影响

Tab.2 Influence of different concentration of Deo on bidirectional transmembrane transport of Rho123 in Caco-2 cell modeln=3

表3 不同浓度Deo对CsA在Caco-2细胞模型中双向跨膜转运的影响
Tab.3 Influence of different concentration of Deo on bidirectional transmembrane transport of CsA in Caco-2 cell modeln=3
Deo浓度/
(μg·mL-1)
Papp PDR
BL→AP AP→BL
CsA 17.76±1.91 2.06±0.60 8.62
CsA+ Deo
10 14.58±1.60*1 1.55±0.93 9.41
20 13.61±1.29*2 1.50±0.85 9.07
40 12.84±1.16*2 1.51±0.95 8.50
80 12.17±1.58*2 2.60±0.73 4.68
160 12.47±1.06*2 2.06±1.01 6.05

Compared with CsA, *1P<0.05,*2 P<0.01

与CsA比较,*1P<0.05,*2 P<0.01

表3 不同浓度Deo对CsA在Caco-2细胞模型中双向跨膜转运的影响

Tab.3 Influence of different concentration of Deo on bidirectional transmembrane transport of CsA in Caco-2 cell modeln=3

2.3 Deo对P-gp探针药物药动学的影响

图1显示灌胃给予不同浓度Deo后,大鼠血浆Rho23浓度随时间的变化。如图1所示,口服Deo或维拉帕米组大鼠血浆Rho123浓度均低于空白对照组,Deo对浓度的抑制作用呈现剂量相关性。药动学参数结果见表4。表明Deo可剂量依耐性抑制Rho123的峰浓度(Cmax)和AUC, 而对半衰期(t1/2)和达峰时间(tmax)无影响。同时Deo可剂量依耐性减少表观清除率(CLz)和表观体积(Vz),但差异无统计学意义。

表4 5组大鼠Rho123药动学参数
Tab.4 Pharmacokinetic parameters of Rho123 in rats x¯±s,n=8
组别 AUC0-t/
(mg·L-1·h)
AUMC0-t/
(mg·L-1·h2)
t1/2 tmax
min
CLz/
(L·h-1·kg-1)
Vz/
(L·kg-1)
Cmax/
(mg·L-1)
空白对照组 51.81±9.68 700.2±173.9 12.06±3.02 1.407±0.685 87.22±27.85 2 168±462 3.765±0.799
维拉帕米组 86.96±8.83*3 1 205.0±189*2 14.24±3.71 1.577±0.548 54.89±10.09*2 1 676±408 7.172±2.833*2
Deo小剂量组 57.98±9.87 794.0±164.5 12.15±3.24 1.444±0.748 83.12±27.76 2 019±467 3.937±1.174
Deo中剂量组 66.85±8.94*2 959.9±215.9*1 13.99±3.25 1.583±0.579 71.31±25.42 1 909±357 4.518±0.732*1
Deo大剂量组 78.07±8.66*3 1 108.9±238.1*2 14.31±3.51 1.683±0.824 60.41±6.57*1 1 765±443 4.726±0.898*1

Compared with blank control group, *1P<0.05,*2P<0.01

与空白对照组比较,*1P<0.05,*2P<0.01

表4 5组大鼠Rho123药动学参数

Tab.4 Pharmacokinetic parameters of Rho123 in rats x¯±s,n=8

图1 5组大鼠Rho123血浆浓度-时间曲线(x¯±s,n=8)

Fig.1 Plasma concentration-time profiles of Rhodamin123 in five groups of rats (x¯±s,n=8)

3 讨论

Papp值可反映药物在体内的吸收情况,>1×10-6 cm·s-1表明该药物容易吸收;<1×10-7 cm·s-1表明药物在体内难以吸收。在本研究中,不同浓度Deo的Papp随浓度变化而波动,但均>2×10-6 cm·s-1,表现出良好的胃肠道吸收特征。PDR值反映P-gp转运子对药物在肠道跨膜转运的选择性,若>2则需进一步实验证实药物是否是P-gp底物;若<1.5则否定这一可能。本研究结果显示Deo的PDR不随药物浓度而改变,维持在约为1.0,显示P-gp对Deo的跨膜转运无选择性,表明Deo主要通过被动转运方式在肠道透膜吸收。

为了研究Deo对P-gp的影响,选用两种不同的P-gp底物——CsA和Rho123。虽然Deo对它们的抑制效应有所差异,但在20~160 μg·mL-1范围内均显著抑制它们BL→AP向的跨膜转运,并呈剂量相关性。根据体外药物浓度,推算体内给药浓度,从药动学方面体内研究Deo对P-gp的影响。血浆浓度-时间曲线显示Deo各剂量组大鼠血浆浓度分布于空白对照组和维拉帕米组,且有剂量相关性。药动学参数表明,Deo可加快Rho123体内排泄速率(CLz增加),而不影响其半衰期。综上所述,五味子甲素是P-gp抑制药而非P-gp底物。

药物联合应用的情况在临床中较为普遍,临床和研究发现一些药物联用将导致药物相互作用的发生。五味子制剂由于其降酶护肝的作用,在临床上联用的情况十分常见。临床实践发现,五酯胶囊(五味子制剂)可显著升高他克莫司的血浓度和生物利用度[7-8]。Deo是五味子制剂重要的活性单体成分,本身具有对抗保护心肌缺血-再灌注损伤[9]、谷氨酸诱导的神经毒性[10]、Aβ1~42诱导的记忆障碍[11]、自发神经递质释放[12]和过氧化氢诱导的细胞凋亡[13]。五酯胶囊也是以Deo含量作为其质量标准,其口服剂量为每日6粒,每粒含五味子甲素11.25 mg,即67.5 mg·d-1。将临床口服剂量换算为大鼠的口服剂量,约为8 mg·kg-1

在本研究中,8 mg·kg-1的Deo对P-gp的抑制效应有限(与空白对照组比较,合用8 mg·kg-1Deo的AUC仅增加12%),不能达到显著升高P-gp底物药物浓度、提高药物疗效和口服生物利用度的作用。结合笔者前期的研究结果(合用8 mg·kg-1的Deo,CYP3A底物——咪达唑仑的AUC升高46%)[14],推测临床口服Deo制剂所导致的药物相互作用,机制是以抑制CYP3A为主、抑制P-gp为辅的共同作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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五味子甲素
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Caco-2细胞模型
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罗丹明123
环孢素A

Deoxyschizandrin
P-glycoprotein
Caco-2 cell model
Pharmacokinetics
Rhodamine123
Cyclosporine A

作者
李维亮
宋建军
辛华雯

LI Weiliang
SONG Jianjun
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