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医药导报
医药导报, 2017, 36(2): 193-196
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2017.02.019
超声-酶法提取两面针中血根碱的工艺优选*
Technology Optimization of Ultrasonic-enzyme-assisted Extraction of Sanguinarine from Zanthoxylum nitidum
陆世惠1,, 陈冉2, 林瑶1, 陈楠1, 朱晓莹2
1.右江民族医学院 药学院
2.右江民族医学院 科学实验中心,百色 533000
LU Shihui1,, CHEN Ran2, LIN Yao1, CHEN Nan1, ZHU Xiaoying2
1. Department of Pharmacy Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, China
2. Science Experiment Center, Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, China

作者简介 陆世惠(1981-),男,广西藤县人,高级实验师,博士,从事天然产物的提取分离鉴定及其生物活性研究。电话:0776-2829035,E-mail:lushihui0818@126.com。
基金资助: 广西自然科学基金资助项目(2014GXNSFBA118185)
中图分类号: R284.2     文献标识码: B     文章编号: 1004-0781(2017)02-0193-04
摘要: 目的优化超声-酶法提取两面针中血根碱的工艺条件。方法以高效液相色谱(HPLC)法测定血根碱提取率为指标,考察提取溶剂加酸和酶解预处理对两面针超声提取的适用性,正交实验优化超声功率、提取次数和溶剂量,最后动态过程优化超声提取时间。结果最佳工艺条件为:两面针复合酶预处理后,以体积分数40%乙醇(含盐酸0.2%)超声(250 W)提取3次,第1次以6倍量溶剂提取15 min,第2,3次各以3倍量溶剂提取12 min,血根碱提取率为88.6%。结论该提取工艺经济、高效、节能、省时,可为开发利用血根碱提供实验基础。
关键词: 两面针 ; 血根碱 ; 超声-酶法 ; 提取工艺

Abstract:
ObjectiveTo optimize the technology conditions of ultrasonic-enzyme-assisted extraction for sanguinarine from Zanthoxylum nitidum. MethodsExtraction rate of sanguinarine determined by HPLC was served as an index. The applicability of the extraction solvent added with acid and enzymatic hydrolysis pretreatment to the ultrasonic-enzyme-assisted extraction of Zanthoxylum nitidum was investigated. Ultrasonic power, extraction frequency and solvent volume were optimized by orthogonal experiment. Finally, ultrasonic extraction time was optimized in dynamic process. ResultsThe optimal process was as follows: Zanthoxylum nitidum powder was extracted 3 times by ultrasonic-wave (250 W) with 40% ethanol (0.2% hydrochloride) as solvent (extracted for 15 min with 6-fold solvent at the first time, then extracted for 12 min with 3-fold solvent at the second and the third time, respectively). The extraction rate of sanguinarine was 88.6%. ConclusionThe process is economic, efficient, energy- and time-saving, and provides experimental basis for industrial production of sanguinarine.
Key words: ; Sanguinarine ; Ultrasonic-enzyme-assisted ; Extraction technology

两面针[Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.]又名入山虎、麻药藤、入地金牛、红倒钩簕等,系芸香科花椒属植物,主要分布于我国广西、广东、云南、贵州等地[1],主治风湿骨痛、跌打损伤、胃痛、牙痛、毒蛇咬伤等症[2],2010年版《中华人民共和国药典》收载,其中含有较丰富的血根碱。与氯化两面针碱相似,血根碱也具有良好的抗肿瘤活性[3]。目前,两面针的提取工艺研究主要集中于氯化两面针碱[4-6],对于血根碱的提取笔者未见报道。酶法辅助提取是以纤维素酶等水解植物细胞壁中的纤维素等物质,使细胞松弛、破裂,从而促进有效成分的提取,是经济实用的技术。已有研究表明,用复合酶预处理两面针药材,能提高氯化两面针碱、总生物碱和某些其他成分的提取率[6-7],但是否提高血根碱提取率尚未明确。还有研究提示,60%乙醇(含0.5%盐酸)是两面针总生物碱和氯化两面针碱的最佳提取溶剂[6-8],但是否适用于血根碱还不清楚。因此,笔者在本实验研究从两面针中提取血根碱的工艺,明确纤维素酶和酸对其提取的影响,探索高效节能的血根碱提取技术,为血根碱的开发利用提供实验基础。

1 仪器与试药
1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津),SPD-20A紫外检测器(日本岛津),KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山),FA2004N型电子分析天平(上海民析,感量:0.1 mg),101-3型电热鼓风干燥箱(上海圣欣科学仪器有限公司)。

1.2 试药

盐酸血根碱对照品(中国食品药品检定研究院,批号:51001-201101,含量:99.3%),纤维素酶(南宁东恒华道生物科技有限责任公司,规格:10 000 U·g-1,批号: 14060811),果胶酶(南宁东恒华道生物科技有限责任公司,规格:10 000 U·g-1,批号: 14051302),乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。两面针药材购自广西南宁市,经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为两面针[Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.]的根。

2 方法与结果
2.1 血根碱的测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Luna C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:乙腈-水-磷酸-三乙胺(25∶75∶0.2∶0.25),流速:1 mL·min-1,检测波长:284 nm,柱温:30 ℃。

2.1.2 标准曲线的制备 精密称取盐酸血根碱对照品12.5 mg,甲醇溶解定容至10 mL得储备液。精密吸取储备液0.1,0.2,0.4,0.6,0.8和1 mL,以甲醇定容至50 mL,取20 μL进样,重复测定3次,以质量浓度为横坐标,平均积分峰面积为纵坐标,得回归方程Y= 4.365×104 X+1.324×104(r=0.999 2),线性范围2.48~24.80 μg·mL-1。

2.1.3 样品测定方法 取提取液0.5~2.0 mL,以甲醇定容至10 mL,孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,以续滤液作为供试液,取供试液20 μL进样,重复测定2次,以平均积分峰面积根据回归方程计算血根碱的提取率,提取率(%)=提取的血根碱质量/药材中血根碱质量×100%。

2.1.4 精密度实验 取10.0 μg·m L-1的对照品溶液反复测定6次,以积分峰面积计算,RSD为0.82%(n=6)。

2.1.5 稳定性实验 取同一供试液,依法分别于0,4,8,16,24,48 h测定,计算血根碱浓度,RSD为1.18%(n=6)。

2.1.6 重复性实验 取一提取液制备供试液,平行5份,依法测定,计算血根碱浓度, RSD为1.34%(n=5)。

2.1.7 加样回收率实验 取已知浓度的提取液适量,平行6份,加入对照品适量,依法测定,计算血根碱浓度,结果平均加样回收率为98.7%,RSD为1.52%(n=6)。

2.2 药材中血根碱含量的测定

将两面针药材粉碎(粒径≤0.5 mm),精密称取6 g,置索氏提取器中,加入甲醇100 mL,加热回流提取至提取液无色(约8 h),提取液定容至100 mL,依法测得药材中血根碱含量为3.34‰。

2.3 两面针提取过程

称取粉碎的两面针(粒径≤0.5 mm)100 g,加入3.7倍量pH值5的醋酸∶醋酸钠缓冲液(0.1 mol·L-1醋酸:0.1 mol·L-1醋酸钠=1∶2),用纤维素酶和果胶酶(酶底物质量比均为1∶250)于室温(30 ℃)下预处理30 min [6-7],100 ℃烘干(部分实验不烘干,直接加入计算量无水乙醇配成相应提取溶剂)后,加入一定量酸性溶剂,以一定功率超声提取一定时间。

2.4 提取工艺的优化

2.4.1 提取溶剂的选择 以18倍量溶剂(平均分配)超声(250 W)提取3次,每次超声20 min,滤过,合并滤液,定容至2 000 mL,取样测定。结果正丁醇、丙酮、无水乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇和20%乙醇的血根碱提取率分别为7.1%,18.9%,22.9%,31.4 %,50.1%,84.6%和65.8%。可见,最佳溶剂是40%(体积分数)乙醇。

2.4.2 溶剂酸碱性对提取的影响 在40%乙醇中添加质量分数为0.5%盐酸、硫酸或醋酸,按“2.4.1”项方法提取。结果血根碱提取率分别为96.2%,92.4%,87.9%,均比不加酸时有所提高。表明酸性条件可以促进血根碱的提取,且加盐酸效果最佳。

另在40%乙醇中添加盐酸的质量分数为0.1%,0.2%,1%,按“2.4.1”项方法提取。结果血根碱提取率分别为90.4%,95.7%,96.0%,表明0.2%盐酸即可获得良好提取率。

2.4.3 酶解预处理对提取的影响 称取未经酶解预处理的两面针(粒径≤0.5 mm)100 g,以40%乙醇(含0.2%盐酸)为溶剂,按“2.4.1”项方法提取。结果血根碱提取率为85.3%,比经酶解预处理时低。证明酶解预处理可促进血根碱的提取。

2.4.4 正交实验 根据“2.4.2”结果,以40%乙醇(含0.2%盐酸)超声提取,每次提取20 min,设计L9(34)正交实验考察超声功率(A)、提取次数(B)及溶剂量(C),各次提取溶剂量分配为12=6+6=6+3+3,15=9+6=6+5+4,18=10+8=7+6+5,对血根碱提取率的影响。因素水平见表1。

表1 超声提取血根碱因素水平表
Tab.1 Factors and levels of ultrasonic extraction for sanguinarine
水平 功率(A)/W 提取次数(B) 溶剂量(C)/倍
1 150 1 12
2 200 2 15
3 250 3 18

表1 超声提取血根碱因素水平表

Tab.1 Factors and levels of ultrasonic extraction for sanguinarine

把各次滤液合并,定容至2 000 mL,取样测定,重复实验1次,测定结果取均值,正交实验安排与结果见表2,方差分析见表3。可见,影响因素B>A>C,A和B因素均有显著影响,C因素无显著影响,以A3B3C1为最佳,即超声功率为250 W,以12倍量40%乙醇(含0.2%盐酸)为提取溶剂,提取3次(各次提取溶剂量分别为6,3和3倍量)。

表2 L9(34) 正交实验超声提取血根碱结果
Tab.2 Results of L9(34) orthogonal test on ultrasonic extraction for sanguinarine
项目 A B C D(空白) 提取率/%
1 1 1 1 1 64.2
2 1 2 2 2 75.5
3 1 3 3 3 84.2
4 2 1 2 3 73.8
5 2 2 3 1 85.1
6 2 3 1 2 82.1
7 3 1 3 2 78.9
8 3 2 1 3 82.1
9 3 3 2 1 93.3
k1 74.63 72.30 76.13 80.87
k2 80.33 80.90 80.87 78.83
k3 84.77 86.53 82.73 80.03
R 10.14 14.23 6.60 2.04

A.power; B. extraction times; C. solvent volume

A.功率;B.提取次数;C.溶剂量

表2 L9(34) 正交实验超声提取血根碱结果

Tab.2 Results of L9(34) orthogonal test on ultrasonic extraction for sanguinarine

表3 超声提取方差分析
Tab.3 Variance analysis of ultrasonic extraction for sanguinarine
方差来源 SS f F P
A 154.829 2 24.698 <0.05
B 308.282 2 49.176 <0.05
C 69.449 2 11.078 >0.05
D 6.27 2

F0.05(2,2)=19.00 ;A.power; B. extraction times; C. solvent volume;D.error

F0.05(2,2)=19.00 ;A.功率;B.提取次数;C.溶剂量;D.误差

表3 超声提取方差分析

Tab.3 Variance analysis of ultrasonic extraction for sanguinarine

2.4.5 动态过程优化提取时间 按正交实验优选出的工艺进行超声提取,连续超声时间为24 min,在连续提取过程中每隔3 min抽取提取液5 mL,同时补足相同体积的40%乙醇(含0.2%盐酸)。测定各样品液中血根碱浓度,结果见表4。可见,第1次提取15 min后提取液浓度基本稳定,其稳态期为15 min,第2次和第3次提取稳态期均为12 min,这就是各次提取最佳超声时间。

表4 超声提取各时间点提取液中血根碱浓度
Tab.4 Concentration of sanguinarine in extract at different time of ultrasonic-wave assisted extraction mg·L-1
取样时间/min 第1次提取 第2次提取 第3次提取
3 86.4 62.3 32.4
6 158 128 51.8
9 227 201 70.4
12 298 244 89.8
15 331 241 90.1
18 336 242 91.8
21 332 245 89.4
24 335 244 90.5

表4 超声提取各时间点提取液中血根碱浓度

Tab.4 Concentration of sanguinarine in extract at different time of ultrasonic-wave assisted extraction mg·L-1

2.5 最佳提取工艺的验证

按以上优化出的最佳工艺条件平行进行3份实验,结果血根碱平均提取率为88.6%,RSD为1.54%。

3 讨论

氯化两面针碱的最佳提取溶剂是60%乙醇(含0.5%盐酸)[6],本实验发现血根碱的最佳提取溶剂是40%乙醇(含0.2%盐酸),加酸能促进其提取,两者相似而略有不同。氯化两面针碱和血根碱结构相似,其碱式都是亚胺型季铵碱,与相应的盐在药材中存在动态平衡,在盐酸条件下可以实现质子与氢氧根结合转化为相应的盐[9],从而提高其醇水提取率。两者主要区别在于2个甲氧基取代位置不同及是否环合,血根碱的分子对称性不如两面针碱,极性较强,更容易与盐酸反应,故其最佳提取溶剂是比60%乙醇更强极性的40%乙醇,且盐酸用量较少。在血根碱最佳提取条件下,氯化两面针碱提取率仅为43.2%,且用硅胶柱可以很容易实现两者的分离。

纤维素酶作用于植物细胞壁上纤维素中的糖苷键,致使细胞松弛、破裂,细胞内容物更易溶出,对血根碱的结构没有影响,因此酶解预处理两面针可以提高其产率。而动态过程优化超声时间,可以做到准确把握每次提取的最短有效时间,使整个工艺节能省时。原文献中酶解的缓冲液用量是4倍量[6-7],为使工艺流程更简便、节能、减少溶剂,本实验用3.7倍量缓冲液,预处理后不必烘干直接加2.4倍量无水乙醇恰好配成6倍量40%乙醇,即可进行超声提取。而一般后续提取的溶剂量略少,也不宜少于3倍量,且预实验发现每次提取的溶剂量影响较小,故各次提取溶剂量分配为12=6+6=6+3+3,15=9+6=6+5+4,18=10+8=7+6+5。

The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
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目的:探讨血根碱对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用及对血管生成的影响.方法:建立小鼠S180皮下移植瘤模 型,随机分为模型组、环磷酰胺(CTX 20 mg/kg)组、血根碱(10、20、40 mg/kg)组、联合组(血根碱10 mg/kg+CTX20 mg/kg),连续给药10 d后处死小鼠,检测移植瘤质量及体积并计算抑瘤率;HE染色观察肿瘤细胞的形态学特征;免疫组化法检测药物对微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响.结果:与模型组比较,CTX组、血根碱(20、40 mg/kg)组、联合用药组肿瘤生长显著受到抑制;肿瘤组织HE染色显示,与模型组比较给药组中肿瘤细胞异型性降低,病理性核分裂减少,可见散在及融合成 片状的坏死灶;免疫组化显示CTX、血根碱(20、40mg/kg)及联合用药均能显著减少MVD、VEGF的表达,联合用药时抑瘤效果更显著 (P＜0.01,P＜0.05).结论:血根碱可通过下调S180移植瘤组织中MVD、VEGF的表达,从而抑制肿瘤血管的生成发挥抗肿瘤作用.
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为降低两面针生物碱提取过程酸对设备的腐蚀及提高纯化过程的回收率，采用了加酸内部沸腾法强化提取氯化两面针碱，提取液直接用阳离子交换树脂吸附及超声波辅助强化洗脱在树脂表面结晶出来的两面针生物碱晶体。实验结果表明：两面针粉末先用4倍物料量的乙醇盐酸解吸剂解吸，解吸剂中盐酸和乙醇的质量浓度分别为0.61%和80%，然后用16倍物料量的20%质量浓度的乙醇在82℃下提取4 min，在此条件下氯化两面针碱提取得率为0.134%；用732阳离子交换树脂直接在40℃下静态吸附133倍树脂用量的内部沸腾法提取液，用盐酸浓度为3 mol·L-1、乙醇质量浓度为70%的酸乙醇洗脱液在超声波的辅助下间歇解吸附，解吸率达到99%以上，分离得到的氯化两面针碱纯度为94.5%，回收率为77.7%。与传统酸醇回流提取对比，加酸内部沸腾法提取快37.5倍、乙醇和盐酸消耗量减少一倍，对设备腐蚀大为减轻，提取液可以用阳离子交换树脂直接富集分离，氯化两面针碱回收率提高24.2%。
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复合酶预处理两面针药材后,以氯化两面针碱、总生物碱得率和干膏收率为指标,采用正交试验和动态过程优化半仿生-超声法、渗漉法和回流法提取工艺,对其提取效果进行比较。各以4倍量枸橼酸-三乙胺60%乙醇缓冲液（p H 2.0、7.5和8.3）为溶剂,依次超声（250 W）提取15、12和9 min,氯化两面针碱得率2.52‰,总生物碱得率2.15%,干膏收率16.14%。以60%乙醇（5 g/L盐酸）为溶剂,浸润10 min后以10mL/min流速渗漉16倍量溶剂,氯化两面针碱得率2.30‰,总生物碱得率2.18%,干膏收率14.86%。分别用6、5和4倍量60%乙醇（5 g/L盐酸）依次回流15、12和9 min,氯化两面针碱得率2.46‰,总生物碱得率2.36%,干膏收率15.37%。半仿生-超声法和渗漉法比回流法经济,可为工业生产提供参考依据。
URL    
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目的 优选酶解预处理后浸渍提取两面针中氯化两面针碱的工艺.方法 用正交实验法研究pH、酶解温度、时间等酶解因素和溶剂、次数、时间等浸渍提取因素对氯化两面针碱提取率的影响.结果 最佳工艺条件为:纤维素酶、果胶酶底物质量比均为1∶250,4倍量缓冲液(pH=5),室温(30℃)下酶解30 min,再以60％乙醇-5g·L-1盐酸室温下浸渍提取3次,溶剂量分别为10,4和3倍量,每次2h,氯化两面针碱提取率85.96％.结论 该工艺经济高效、节能环保,为工业生产奠定了实验基础.
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[9] 王锋鹏. 现代天然产物化学[M]. 北京:科学出版社,2009:862-891.
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