两面针[
LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津),SPD-20A紫外检测器(日本岛津),KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山),FA2004N型电子分析天平(上海民析,感量:0.1 mg),101-3型电热鼓风干燥箱(上海圣欣科学仪器有限公司)。
盐酸血根碱对照品(中国食品药品检定研究院,批号:51001-201101,含量:99.3%),纤维素酶(南宁东恒华道生物科技有限责任公司,规格:10 000 U·g-1,批号: 14060811),果胶酶(南宁东恒华道生物科技有限责任公司,规格:10 000 U·g-1,批号: 14051302),乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。两面针药材购自广西南宁市,经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为两面针[
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Luna C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:乙腈-水-磷酸-三乙胺(25∶75∶0.2∶0.25),流速:1 mL·min-1,检测波长:284 nm,柱温:30 ℃。
2.1.2 标准曲线的制备 精密称取盐酸血根碱对照品12.5 mg,甲醇溶解定容至10 mL得储备液。精密吸取储备液0.1,0.2,0.4,0.6,0.8和1 mL,以甲醇定容至50 mL,取20 μL进样,重复测定3次,以质量浓度为横坐标,平均积分峰面积为纵坐标,得回归方程
2.1.3 样品测定方法 取提取液0.5~2.0 mL,以甲醇定容至10 mL,孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,以续滤液作为供试液,取供试液20 μL进样,重复测定2次,以平均积分峰面积根据回归方程计算血根碱的提取率,提取率(%)=提取的血根碱质量/药材中血根碱质量×100%。
2.1.4 精密度实验 取10.0 μg·m L-1的对照品溶液反复测定6次,以积分峰面积计算,RSD为0.82%(
2.1.5 稳定性实验 取同一供试液,依法分别于0,4,8,16,24,48 h测定,计算血根碱浓度,RSD为1.18%(
2.1.6 重复性实验 取一提取液制备供试液,平行5份,依法测定,计算血根碱浓度, RSD为1.34%(
2.1.7 加样回收率实验 取已知浓度的提取液适量,平行6份,加入对照品适量,依法测定,计算血根碱浓度,结果平均加样回收率为98.7%,RSD为1.52%(
将两面针药材粉碎(粒径≤0.5 mm),精密称取6 g,置索氏提取器中,加入甲醇100 mL,加热回流提取至提取液无色(约8 h),提取液定容至100 mL,依法测得药材中血根碱含量为3.34‰。
2.4.1 提取溶剂的选择 以18倍量溶剂(平均分配)超声(250 W)提取3次,每次超声20 min,滤过,合并滤液,定容至2 000 mL,取样测定。结果正丁醇、丙酮、无水乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇和20%乙醇的血根碱提取率分别为7.1%,18.9%,22.9%,31.4 %,50.1%,84.6%和65.8%。可见,最佳溶剂是40%(体积分数)乙醇。
2.4.2 溶剂酸碱性对提取的影响 在40%乙醇中添加质量分数为0.5%盐酸、硫酸或醋酸,按“2.4.1”项方法提取。结果血根碱提取率分别为96.2%,92.4%,87.9%,均比不加酸时有所提高。表明酸性条件可以促进血根碱的提取,且加盐酸效果最佳。
另在40%乙醇中添加盐酸的质量分数为0.1%,0.2%,1%,按“2.4.1”项方法提取。结果血根碱提取率分别为90.4%,95.7%,96.0%,表明0.2%盐酸即可获得良好提取率。
2.4.3 酶解预处理对提取的影响 称取未经酶解预处理的两面针(粒径≤0.5 mm)100 g,以40%乙醇(含0.2%盐酸)为溶剂,按“2.4.1”项方法提取。结果血根碱提取率为85.3%,比经酶解预处理时低。证明酶解预处理可促进血根碱的提取。
2.4.4 正交实验 根据“2.4.2”结果,以40%乙醇(含0.2%盐酸)超声提取,每次提取20 min,设计L9(34)正交实验考察超声功率(A)、提取次数(B)及溶剂量(C),各次提取溶剂量分配为12=6+6=6+3+3,15=9+6=6+5+4,18=10+8=7+6+5,对血根碱提取率的影响。因素水平见
把各次滤液合并,定容至2 000 mL,取样测定,重复实验1次,测定结果取均值,正交实验安排与结果见
2.4.5 动态过程优化提取时间 按正交实验优选出的工艺进行超声提取,连续超声时间为24 min,在连续提取过程中每隔3 min抽取提取液5 mL,同时补足相同体积的40%乙醇(含0.2%盐酸)。测定各样品液中血根碱浓度,结果见
按以上优化出的最佳工艺条件平行进行3份实验,结果血根碱平均提取率为88.6%,RSD为1.54%。
氯化两面针碱的最佳提取溶剂是60%乙醇(含0.5%盐酸)[6],本实验发现血根碱的最佳提取溶剂是40%乙醇(含0.2%盐酸),加酸能促进其提取,两者相似而略有不同。氯化两面针碱和血根碱结构相似,其碱式都是亚胺型季铵碱,与相应的盐在药材中存在动态平衡,在盐酸条件下可以实现质子与氢氧根结合转化为相应的盐[9],从而提高其醇水提取率。两者主要区别在于2个甲氧基取代位置不同及是否环合,血根碱的分子对称性不如两面针碱,极性较强,更容易与盐酸反应,故其最佳提取溶剂是比60%乙醇更强极性的40%乙醇,且盐酸用量较少。在血根碱最佳提取条件下,氯化两面针碱提取率仅为43.2%,且用硅胶柱可以很容易实现两者的分离。
纤维素酶作用于植物细胞壁上纤维素中的糖苷键,致使细胞松弛、破裂,细胞内容物更易溶出,对血根碱的结构没有影响,因此酶解预处理两面针可以提高其产率。而动态过程优化超声时间,可以做到准确把握每次提取的最短有效时间,使整个工艺节能省时。原文献中酶解的缓冲液用量是4倍量[6-7],为使工艺流程更简便、节能、减少溶剂,本实验用3.7倍量缓冲液,预处理后不必烘干直接加2.4倍量无水乙醇恰好配成6倍量40%乙醇,即可进行超声提取。而一般后续提取的溶剂量略少,也不宜少于3倍量,且预实验发现每次提取的溶剂量影响较小,故各次提取溶剂量分配为12=6+6=6+3+3,15=9+6=6+5+4,18=10+8=7+6+5。
The authors have declared that no competing interests exist.