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医药导报, 2017, 36(6): 614-616
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2017.06.006
含铜节育器植入家兔体内血清铜离子含量测定
Determination of Copper Ion in Rabbit with Implantation of Copper Intrauterine Device
徐小玲, 何开勇, 潘望平, 吕晓君, 胡远华

摘要:

目的 建立植入含铜节育器家兔血清铜离子含量测定方法。方法 采用硝酸对血清样品进行微波消解制样,钪(Sc)、铟(In)作为内标补偿基体效应,采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS法)测定兔血清中铜的含量,分析统计铜离子的释放和代谢规律。结果 家兔放置含铜节育器后,在不同采血时间点,血清铜离子浓度维持在较低且恒定的范围。加样回收率为98.7%~113.3%,RSD均<5%。结论 该方法操作简便、快速,结果可靠,可用于家兔血清铜离子的测定。

关键词: 含铜节育器 ; 铜离子 ; 电感耦合等离子体质谱法

Abstract:

Objective To develop a method for determination of serumal copper ion in rabbit with implantation of copper intrauterine device. Methods At different time points after implantation,the serumal copper ion concentrations were determined by microwave digestion-inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS) using scandium(Sc) and indium(In) as internal standards to compensate sample matrix effects,and the pharmacokinetics parameters were calculated in order to reflect copper ion release and metabolic rule. Results The serumal copper ion concentrations were kept at a low and stable level.The recoveries were in the range of 98.7%-113.3%,with the relative standard deviations of less than 5.0%. Conclusion The analytical method is simple,fast,and can be used for the determination of serumal copper ion in rabbit.

Key words: Copper intrauterine device ; Copper ion ; Inductively coupled plasma mass spectrometry

宫内含铜节育器(Cu-IUD)是我国育龄妇女最主要的避孕措施,它具有安全、长效、简便、可逆、经济等优点。其抗生育效应是通过铜被宫腔液腐蚀溶解产生铜离子(Cu2+),Cu2+的生物毒性能抑制或杀灭精子,同时对孕卵形成、胚胎着床等各环节起抗生育作用,从而大大提高避孕效果[1-3]。微量元素是维持人体正常代谢和生命活动的重要物质,微量元素的缺失和富集均可引起多种疾病[4]。电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)是一种新型元素分析技术,具有极高的检测效率,是痕量、超痕量元素分析领域最先进的方法之一[5]。笔者建立微波消解-ICP-MS法测定家兔血清中Cu2+含量,以植入新型含铜节育器的家兔为研究对象,通过连续监测3个月家兔体内的Cu2+动态变化,考察血清Cu2+是否会在体内产生蓄积,为临床的安全应用提供参考和依据。

1 材料与方法
1.1 实验动物

普通级雌性日本大耳白兔8只,体质量2.5~3.0 kg,武汉生物制品研究所有限责任公司提供,动物生产许可证号:SCXK(鄂) 2012-003,合格证号42010000000814。适应性饲养1周后开始实验。

1.2 样品与试剂

含铜宫内节育器(硅胶∶铜=3∶1),批号:140901,规格:54 mg,常州尚泰医疗科技有限公司;色谱纯硝酸(Merck公司);铜单元素标准溶液(1 000 μg·mL-1 ,批号:159036-2,国家有色金属及电子材料分析测试中心);水由simplicity超纯水机(美国 millipore公司)制备。

1.3 仪器

XS series2电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,赛默飞世尔科技有限公司)。MARS6微波消解仪(美国CEM公司);-80 ℃超低温冰箱(海尔公司);5424高速台式离心机(德国Eppendorf公司)。玻璃容器均用30%硝酸浸泡过夜,洗净后晾干备用。

2 方法与结果
2.1 ICP-MS的工作参数

以锂(Li),铟(In),钴(Co),铀(U)调谐液对仪器最优化,工作参数:雾化室温度2 ℃;提升时间15 s;稳定时间15 s;RF功率1 250 W。用钪(Sc)、In作为内标物以校正基体效应。

2.2 血清样品采集和处理

每只家兔行含铜节育器放置术后放入笼中喂养。分别于术前1 h,术后1,3,7,14,21,28,42,56,70,84 d自耳缘静脉采血,每次每只2 mL;室温下静置1 h,800×g离心10 min,血清于-80 ℃冰箱保存备用。精密吸取融化后血清样品0.2 mL,置耐压耐高温微波消解罐中,准确加入3%硝酸溶液5 mL,盖好聚四氟乙烯罐盖,放入消解仪的转盘中,按优化后的微波消解条件(表1)进行消解,消解液于110 ℃除酸40~50 min后,转移至10 mL量瓶中,少量水洗涤消解罐,合并至量瓶中,用水稀释至刻度,混匀,即为待测样品溶液。

表1 微波消解条件
Tab.1 Microwave digestion procedure
步骤 功率/W 升温时间/min 温度/℃ 保持时间/min
1 1 600 5 130 10
2 1 600 5 150 15
3 1 600 5 185 25

表1 微波消解条件

Tab.1 Microwave digestion procedure

2.3 线性关系考察

精密量取铜的单元素标准溶液(1 000 μg·mL-1)1 mL,置于200 mL 量瓶中,用3%硝酸溶液稀释至刻度,摇匀,即得5 000 μg·L-1 的铜离子标准储备液I,用3%硝酸溶液稀释制成含铜离子为100,50,20,10,5,1 μg·L-1 的系列铜离子标准溶液。由蠕动泵分别导入仪器,照“2.1”项测定,计算机自动绘制标准曲线。Y=3 919.3X+10 306.2,r=0.999 6。结果表明:铜离子在1~100 μg·L-1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.4 检测限

取3%硝酸溶液作为空白溶液导入仪器,照“2.1”项连续测定10次,并以10倍标准偏差计算铜离子的检测限,结果为0.026 μg·L-1

2.5 加样回收实验

精密量取铜离子标准储备液I 8,20,50 mL,置于100 mL量瓶中,用3%硝酸溶液稀释制成含铜为400,1 000,2 500 μg·L-1铜离子标准溶液。随机选取10份空白血清样品各0.2 mL,1份不加标,另9份分别加入上述3种不同浓度的铜离子标准溶液0.2 mL,每个浓度平行制备3份,充分混匀后,照血清样品溶液的方法制备加样回收实验溶液,分别导入仪器测定,在线加入内标,按标准曲线法计算铜的含量,并计算回收率。结果平均回收率98%~113%,RSD均小于5%,见表2。

表2 加样回收实验结果
Tab.2 Results of recovery test
原有量 加入量 测得量 回收率 平均回收率 RSD
(μg·L-1) %
347.9 400 781.1 108.3 113.3 3.9
347.9 400 813.9 116.5
347.9 400 808.7 115.2
347.9 1 000 1 413.9 106.6 109.3 3.6
347.9 1 000 1 421.8 107.4
347.9 1 000 1 486.9 113.9
347.9 2 500 2 885.4 101.5 98.7 4.5
347.9 2 500 2 687.9 93.6
347.9 2 500 2 872.7 101.0

表2 加样回收实验结果

Tab.2 Results of recovery test

2.6 精密度实验

取空白血清0.2 mL,置耐压耐高温微波消解罐中,加入1 000 μg·L-1铜离子标准溶液0.2 mL,照“2.2”项制备成含铜离子浓度为20 μg·L-1的血清样品溶液,导入仪器连续进样测定6次,结果RSD为0.99%,表明方法的精密度良好。

2.7 稳定性实验

在空白血清中分别加入400和2 500 μg·L-1的铜离子标准溶液,照“2.2”项制备成含铜离子浓度分别为8和50 μg·L-1的血清样品溶液各3份,室温下放置24 h后,测定铜离子含量,测得量占加入量的百分比均在98.4%~112.9%之间,提示处理的血浆样品室温下放24 h内稳定性良好。

2.8 样品测定

按“2.1”项仪器参数,将待测样品溶液导入仪器中测定,在线加入Sc、In内标,以标准曲线法测定待测样品溶液中铜离子的浓度,计算血清铜离子浓度,结果见表3,以DAS3.0软件绘制的血清铜离子释放曲线见图1。

表3 血清中铜离子测定结果
Tab.3 Determination results of serum copper ion μg·L-1
动物号 0 d 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 42 d 56 d 70 d 84 d
1 308.4 282.6 526.0 456.2 380.3 431.7 352.1 432.9 694.5 515.5 852.5
2 310.2 327.0 491.3 482.0 447.6 521.0 494.6 523.5 704.0 585.5 618.5
3 379.5 461.9 408.9 482.0 447.2 306.9 288.7 481.1 352.8 411.3 518.5
4 331.7 392.3 419.1 803.0 605.5 792.5 615.0 580.5 532.0 519.5 456.0
5 348.9 339.0 481.8 495.4 389.4 502.5 524.5 560.5 676.5 697.0 724.5
6 316.7 457.2 546.0 419.3 410.3 331.7 371.2 482.7 596.0 504.5 369.3
7 344.3 422.3 499.8 511.0 345.2 369.3 397.0 451.6 558.0 400.6 517.5
8 377.5 435.0 575.5 339.1 342.9 332.7 294.7 417.5 490.2 421.8 242.4
均值 339.6 389.6 493.5 498.5 421.0 448.5 417.2 491.3 575.5 507.0 537.4
标准差 28.2 66.4 57.8 134.6 84.6 160.4 116.4 59.0 119.8 100.2 194.0

表3 血清中铜离子测定结果

Tab.3 Determination results of serum copper ion μg·L-1

图1 血清铜离子释放曲线

Fig.1 Release profile of serumal copper ion

3 讨论

笔者ICP-MS法测定家兔血清铜离子的方法,优化微波消解条件,并通过标准曲线、检出限、回收率、精密度对该方法进行了研究。结果表明,本法操作简单,快速,灵敏,线性范围宽。微波消解法是直接通过加热样品使其吸收能量,在密闭的情况下通过加压使样品在高温高压环境下与酸有效的接触,既加快反应速率,同时使血液中包括细胞在内的有形成分充分溶解、破碎[6]。微波消解法的铜加标实验回收率均>95%,测定结果更加真实反映所测样品铜元素的含量。

笔者在本实验使用人用含铜IUD植入家兔子宫体内,部分模拟人体带环后含铜IUD血清Cu2+代谢的规律,通过系统评价和测定含铜IUD家兔子宫内放置不同时间后血清Cu2+的变化,建立含铜IUD临床前血清Cu2+代谢评价的方法,为今后国内外进行含铜IUD血清Cu2+代谢研究提供技术指导和参考。实验结果提示家兔在子宫内放置该含铜IUD后3个月内,血清Cu2+浓度维持在较低且恒定的范围,未出现“暴释”,提示其长期应用不会出现体内蓄积。不过临床IUD放置长达数年甚至数十年,所以下一步准备使用模拟宫腔液测定更长时间含铜IUD的铜离子释放情况,以更好地为临床放置IUD后血清Cu2+的代谢规律提供参考和借鉴。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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目的:应用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定枸杞子中铜含量并进行不确定度评定,为评价该方法提供科学依据。方法采用微波消解-ICP-MS 法测定中药枸杞子中铜的含量,选取同位素63 Cu 进行测定,分析测定流程中不确定度分量并计算合成不确定度。结果枸杞子供试液中铜含量扩展不确定度为17.367μg·mL^-1,含量为(186.740±17.367)μg·mL^-1,即原药材中铜含量为(46.685±4.342)μg·kg^-1。样品消解、检测设备、标准溶液配制等均为不确定度来源。结论应规范实验操作和仪器使用以保证测量结果准确、可靠。同时,建立中药中重金属及有害元素检测的不确定分析,完善测定方法学考察,减少实验误差,建立标准化实验操作规范。
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[本文引用:1]
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徐小玲
何开勇
潘望平
吕晓君
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HE Kaiyong
PAN Wangping
LYU Xiaojun
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