Shimadu LC20A高效液相色谱仪(LC-20AD四元泵,SPD-M20A检测器,SIL-20A进样器 日本岛津公司),KQ-500VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),CPA225D电子天平(德国赛多利斯,感量:0.01 mg),HHS-2S型电子恒温不锈钢水浴锅(上海宝蓝实验仪器制造有限公司),YLD-2000电热恒温鼓风干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司)。

刺五加(湖北聚瑞中药饮片有限公司,批号:151001),何首乌(安徽方氏药业,批号:160301),以上两味药材经我院张思波主任药师鉴定为道地药材;紫丁香苷对照品(批号:111574-201003),大黄素对照品(批号:0922-201506),均由中国食品药品检定研究院提供。

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Inertsil ODS-SP C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇(A)-0.4%磷酸溶液(B),梯度洗脱:0~15 min,15%→25%A,>15~25 min,25%→35%A,>25~45 min,35%→55%A,>45~60 min,55%→80%A,>60~70 min,80%→100%A。流速:1 mL·min^-1,柱温:35 ℃,检测波长:254 nm。

2.1.2 供试品溶液的制备 按照处方比例称取刺五加和何首乌,加10倍量水,煎煮2 h,煎煮2次,放冷,滤过,合并煎煮液,蒸干,得水提部位干浸膏。取适量水提部位干浸膏,粉粹为细粉,精密称取1 g,置于50 mL具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,精密称量,超声提取(功率500 W,频率45.80 kHz)45 min,取出,擦干瓶身表面的水,待冷却至室温后精密称定,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,过孔径0.45 μm微孔滤膜,即得供试品溶液。

2.1.3 混合对照品溶液的制备 精密称定对照品紫丁香苷和大黄素,加甲醇制成每毫升分别含紫丁香苷0.028 1 g、大黄素0.001 3 g的混合对照品溶液,备用。

2.1.4 系统适应性实验 按照“2.1.1”项色谱条件,移取混合对照品和供试品溶液进样,记录色谱图,结果见图1。

2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.3”项混合对照品溶液2,4,6,8,10,12 μL,注入高相液相色谱仪,测定紫丁香苷和大黄素的峰面积。以最小二乘法进行线性回归得到各成分的回归方程以及线性范围,结果见表1。由表1可知,待测成分在相应的范围呈良好的线性关系。

2.1.6 精密度实验 依据“2.1.1”项色谱条件,精密吸取混合对照品溶液10 μL,重复进样6次,记录各待测成分的峰面积,计算RSD。结果紫丁香苷和大黄素峰面积的RSD分别为2.0%,1.9%,结果表明该仪器的精密度较好。

2.1.7 稳定性实验 取“2.1.2”项供试品溶液,并按照“2.1.1”项色谱条件,分别于制样后0,2,4,8,12 h,吸取该供试品溶液10 μL,进样、测定,记录各待测成分峰面积,计算RSD。结果紫丁香苷和大黄素峰面积的RSD分别为0.8%,1.6%,结果表明该溶液在12 h稳定性较好。

2.1.8 重复性实验 取“2.1.2”项供试品溶液6份,依据“2.1.1”项色谱条件进样,测定各待测成分峰面积,计算RSD。结果紫丁香苷和大黄素峰面积的RSD分别为2.3%、0.4%,结果表明该方法的重复性良好。

2.1.9 回收率实验 采用加样回收法,各取已知含量的样品5 mL 6份,分别按照1∶0.8,1∶1,1∶1.2加入混合对照品,依法制备供试品溶液。按“2.1.1”项色谱条件,精密吸取各供试品溶液10 μL,注入色谱仪,测定各待测成分峰面积,计算各待测成分的回收率和RSD。结果紫丁香苷、大黄素的平均加样回收率分别为98.6%,99.58%,RSD分别为1.5%、2.8%,结果显示该方法的准确度较高。

精密吸取水提取液50 mL,置于已干燥至恒质量的蒸发皿中,水浴蒸干;105 ℃下干燥5 h,于干燥器中冷却30 min,快速称取质量,直至样品质量达到恒重,计算固形物保留率。

2.3.1 因素与水平的确定及实验方案 查阅相关资料^[6-9],并通过预实验可知,影响水提工艺的因素主要有提取次数、提取时间、加水倍量。提取次数为非连续变量,根据预实验结果确定提取次数为2次,并最终确定各因素的水平取值,采用软件Design-Expert8.0.5中的中心组合实验设计原理及响应面分析法对银杏活脑胶囊水提部位提取工艺进行优选。以加水倍量(A)、提取时间(B)作为考察因素,每个自变量的水平分别以-1.414,-1,0,1,1.414进行编码,以紫丁香苷转移率(T₁)、大黄素转移率(T₂)和固形物保留率(S)作为评价指标。因素与水平见表2。按处方比例称取药材,按照表3的响应面分析方案进行实验。并按照紫丁香苷和大黄素含量测定方法进行测定,计算各实验组二者转移率及固形物保留率。

2.3.2 实验数据处理方法 目标成分转移率计算公式为:水提液中目标成分含量/投料饮片中目标成分含量,固形物保留率计算公式为:水提液干膏固形物量/药材量^[10]。采用SPSS statistics数学软件将数据进行归一化处理,按照归一化方法计算公式处理数据,紫丁香苷转移率和大黄素转移率归一化为D_max=(V_n-V_min)/(V_max-V_min),固形物保留率计算公式为D_min=(V_max-V_n)/(V_max-V_min),总评归一值OD=(D ₁ D ₂…D _n)^1/n,n=指标数,D₁、D ₂、D ₃分别为紫丁香苷转移率、大黄素转移率和固形物保留率的归一值,总评归一值将作为响应面参考值的直接指标代入Design-Expert8.0.5软件进行分析,结果见表3。

2.3.3 模型的建立及显著性检验 用ANOVA分析响应面的回归参数,以总评值OD的方差分析见表4,可知,二次项B²达到极显著水平,A²<0.05,二次项各因素对响应值OD的线性关系显著;一次项AB对响应值T的曲面效应显著。利用Design-Expert8.0.5软件对表4数据进行多元回归拟合,得到响应值OD对加水倍量(A)、提取时间(B)的二次多项回归模型:拟合总评OD=0.910 6A+0.038 2B-0.037 7A²-1.015×10^-4B²-1.293×10^-3AB。该方程的相关系数r=0.999 4。相对于线性拟合模型有显著提高,表明该方程有较大可信度。

由表4可知,该模型达到极显著水平(P<0.001),表明该二次方程的模型比较显著。

2.3.4 效应面分析与优化 采用Design-Expert软件,以“2.3.3”项拟合的数据模型为基础,绘制出相应的等高线图和自变量对因变量的三维曲线图,见图2。通过软件预算处最优提取工艺参数为:A=9.94倍,B=159.1 min。综合考虑各方面因素,最终确定优选工艺为加水10倍,提取时间160 min。

2.3.5 优选提取工艺验证实验 按效应面分析得到优选提取工艺,即:加水倍量为10倍,提取时间为160 min,平行3次实验。按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液,再按照色谱条件测定紫丁香苷和大黄素含量,计算转移率,并计算固形物保留率。结果见表5。

由表5可知,效应面实验得出的优选提取工艺为加水倍量为10倍,提取时间160 min,此条件下紫丁香苷转移率可接近99%,大黄素转移率可达到93%以上,固形物保留率可降低至22.0%,其重复性较好。

按照处方组成,水提部位由刺五加和何首乌两味中药组成。刺五加主要有效成分为紫丁香苷,何首乌的主要有效成分为大黄素,二者均具有抗氧化的作用^[11-12],属于处方中重点保留的成分,故选择紫丁香苷和大黄素作为评价指标。固形物保留率是中药制剂质量的重要指标之一,银杏活脑胶囊水提部分提取物中含有皂苷成分和多糖成分较多,多糖成分及一些杂质增多不仅影响单位剂量药物的疗效,而且会导致制剂吸潮,从而使制剂稳定性降低,故降低水提物的固形物保留率也常常作为提取工艺中的重要指标。

首先以单一组分进行进样分析,紫丁香苷的流动相为甲醇-水,大黄素的流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液,分别对以上2种流动相进行分析,所检测出来的结果均不理想,综合各种因素,故将其调整为甲醇-0.4%磷酸溶液,该系统条件下,由于非目标峰影响目标峰,并且由于紫丁香苷和大黄素极性相差较大,为了更好地分离二者,故考虑适当调整流动相比例,延迟大黄素出峰时间。

采用等吸收图和3D全波长数据采集方法,在波长190~400 nm对样品溶液进行谱图信息分析,并分别选取203,215,254,265,285,306,350和385 nm 8个不同波段进行比对考察,综合分析,大黄素和紫丁香苷分别在254和265 nm处有特征吸收,二者最大吸收波长较为接近,相对紫丁香苷而言,大黄素峰面积较小,综合考虑,最终确定以254 nm为最佳检测波长。

本研究主要针对银杏活脑水提部位的提取工艺进行优化,通过对水提部位处方进行分析,主要针对其中紫丁香苷与大黄素的转移率变化进行比较,在前期研究过程中已经确定基本提取方法,本研究只能调整提取参数,故选择研究方法应具备较好的实验精度和具备较好的预测性能,目前研究较为成熟的方法有正交实验设计、效应面实验设计和均匀实验设计,通过查阅相关资料,分析结合实验可行性,最终确定中心组合设计-效应面法为研究方法。

通过对本研究得出的最优工艺与正交实验设计优选的优选工艺进行比较,结果发现,中心组合设计-效应面法实验精度更高,预测值更准确,符合相关文献资料的论述^[13],故中心组合设计-效应面法更适用于筛选银杏活脑胶囊的提取工艺。