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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
《乌利希期刊指南》
WHO《西太平洋地区医学索引》来源期刊
日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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, 张风岭, ZHANG Fengling
目的 采用高效液相色谱(HPLC)法测定枇杷叶及其制剂中三萜类成分含量,初步探索熊果酸和齐墩果酸作为枇杷叶制剂定量检测标志性化合物的可能。方法 比较枇杷叶膏样品两种脱糖方式。用HPLC分析枇杷叶药材及其制剂中熊果酸和齐墩果酸的含量。色谱柱为迪马Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.1%磷酸水(95∶5)为流动相,流速0.5 mL·min-1,柱温30 ℃,进样量10 μL,检测波长210 nm。结果 枇杷叶药材及其制品中均含有熊果酸和齐墩果酸,且含量均比较稳定。结论 熊果酸和齐墩果酸可作为枇杷叶制剂定量控制的标志性化合物。
Objective To determine the triterpenoid content in
枇杷叶为蔷薇科植物枇杷[
Agilent 1260高效液相色谱仪,G1311B四元泵,G4212B DAD阵列二极管检测器;超声波中药处理机(山东济宁鲁超超声设备有限公司,型号:LC-350);电子分析天平(日本岛津,型号:AUW120D,感量:0.1/0.01 mg)。
熊果酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110742- 201421,含量:93.8 %),齐墩果酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110709- 200304,含量≥98 %); 枇杷叶分别采自福建、云南、浙江、安徽、湖南邵阳、湖南怀化、江苏南京等7个地区(经湖南医药学院梅树模副教授鉴定);枇杷叶膏 (北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,批号: 14130719,规格:每瓶150 g),枇杷止咳颗粒(贵州神奇药业有限公司,批号:140864,规格:每袋3 g);磷酸、乙腈、甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
色谱柱为迪马Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸(95∶5),流速0.5 mL·min-1,柱温30 ℃,进样量10 μL,检测波长210 nm。
取熊果酸、齐墩果酸6.21,2.01 mg,精密称定,置10 mL棕色量瓶中,用甲醇定容,分别配制成含有熊果酸621 μg·mL-1,齐墩果酸201 μg·mL-1的对照品溶液,经孔径0.45 μm滤膜滤过,即得。
2.3.1 药材供试品溶液的制备 取上述8个枇杷叶药材样品粉末各4.0 g,精密称定,加入95%乙醇200 mL,超声提取30 min,补重,经孔径0.45 μm滤膜滤过,按“2.1”项色谱条件进样,即得。
2.3.2 制剂供试品溶液的制备 取贵州神奇枇杷止咳颗粒3.11 g,精密称定,加入水15 mL,浓氨水0.5 mL,乙酸乙酯20 mL,连续萃取3次,取上层液,水浴挥干溶剂,精密加入甲醇60 mL,过孔径0.45 μm滤膜,即得。取枇杷叶膏4.71 g,精密称定,加入水15 mL,浓氨水0.5 mL,乙酸乙酯20 mL,连续萃取3次,得上层液,水浴挥干溶剂,精密加入甲醇60 mL,过0.45 μm滤膜,按“2.1”项下色谱条件进样,即得。
2.3.3 阴性对照溶液 分别按照枇杷止咳颗粒和枇杷叶膏制备工艺,并按照“2.3.1”和“2.3.2”项方法,制备缺枇杷叶的阴性对照溶液。
取“2.2”和“2.3”项对照品溶液,供试品溶液和阴性对照溶液,按照“2.1”项色谱条件进样,记录色谱图。分别得到对照品、浙江药材和枇杷叶膏、枇杷止咳颗粒色谱图,结果见
图1
6种溶液的HPLC色谱图
A1.枇杷叶膏阴性对照溶液;A2.枇杷止咳颗粒阴性对照溶液;B.对照品溶液; C.浙江枇杷叶;D.枇杷叶膏;E.枇杷止咳颗粒;1.齐墩果酸;2.熊果酸
Fig.1
HPLC chromatogram of six kinds of solution
A1.negative control of
精密移取“2.2”项对照品溶液各5.0 mL置10 mL量瓶中,定容,配制成含熊果酸和齐墩果酸分别为310.50和100.50 μg·mL-1的混合对照品原溶液,并将此溶液分别稀释至2,5,10,20,40倍,得熊果酸质量浓度系列为310.50,155.25,62.10,31.05,15.53,7.76 μg·mL-1;齐墩果酸质量浓度系列为100.50,50.25,20.10,10.05,5.03,2.51 μg·mL-1,按“2.1”项下色谱条件按进样,以峰面积(
精密吸取“2.5”项混合对照品原溶液10 μL,重复进样6次,测得熊果酸峰面积积分值RSD为0.31%,齐墩果酸峰面积积分值RSD为1.21%。
取新配制的混合对照品溶液及新制备的福建产枇杷叶供试品提取溶液,分别于 0,2,4,8,12 h 进样,记录色谱峰面积的变化,结果对照品溶液熊果酸峰面积RSD=3.25%,齐墩果酸峰面积RSD=3.68%;供试品熊果酸峰面积RSD=4.17%,齐墩果酸峰面积RSD=4.36%。表明混合对照品溶液和供试品溶液在12 h 内稳定。
精密称取福建产枇杷叶药材5份,按照“2.3.1”项方法制备供试液,按照“2.1”项色谱条件进样,测得齐墩果酸平均含量为0.57%,RSD为1.57%,熊果酸平均含量为1.06%,RSD为0.43%。
取枇杷止咳颗粒3.11,3.08,3.15,3.12,3.10 g,精密称定,分别加入适量齐墩果酸、熊果酸对照品,加入水15 mL,浓氨水0.5 mL,乙酸乙酯20 mL,连续萃取3次,得上层液,挥干,用甲醇定容50 mL。过孔径 0.45 μm滤膜,按“2.1”项色谱条件进样,结果见
表1 齐墩果酸和熊果酸的加样回收率
Tab.1 Recoveries of oleanolic acid and ursolic μg
精密移取“2.3”项供试品溶液,按照“2.1”项色谱条件进样,测得各个药材和制剂中2种活性成分的百分含量见
表2 药材和制剂中齐墩果酸和熊果酸的百分含量
Tab.2
Percentage contents of oleanolic acid and ursolic acid in medicinal material and the preparation %,
笔者在本实验中考察枇杷叶膏的两种去糖方法:方法一,取枇杷叶膏5 g,先用纯化水15 mL溶解,再用100%乙醇45 mL沉淀,滤过,取滤液挥干,用甲醇2 mL溶解制备供试品,但没有测到相应的物质。方法二,称取枇杷叶膏5 g,加入水15 mL,乙酸乙酯20 mL,浓氨水0.5 mL,连续萃取3次,取上层液,过孔径0.45 μm滤膜,按“2.1”项色谱条件进样,效果较佳。故本实验采用方法二进行供试品的制备。
对不同的流动相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液)和洗脱程序进行考察分析,最后确定本实验的色谱分析方法;齐墩果酸和熊果酸的最大吸收峰出现在210 nm,故选择210 nm做为本实验的测定波长。
实验发现,相对于齐墩果酸,熊果酸在复方中的相对含量明显降低,在单方制剂中含量却明显增加,说明复方成分对熊果酸的含量可能有较大影响,在加样回收率实验中同样观察到熊果酸的加样回收率有明显低于齐墩果酸,可能与复方成分的相互作用有关,其相关性有待下一步深入研究。
笔者在已有研究基础上,应用HPLC法对产自福建、云南、江、安徽、湖南邵阳、湖南怀化、江苏南京7个产地的8个枇杷叶药材样品以及枇杷止咳颗粒和枇杷叶膏中三萜类成分进行比较研究,发现上述样品中均含有熊果酸和齐墩果酸,且在药材和制剂中含量均比较稳定,故认为熊果酸和齐墩果酸可作为枇杷叶制剂定量检测指标。
The authors have declared that no competing interests exist.
