目的 研究红花龙胆血清药物化学,探讨红花龙胆药效作用的物质基础。方法 采用血清药物化学研究方法,在建立红花龙胆高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的基础上,比较红花龙胆提取物、红花龙胆含药血清、空白血清HPLC指纹图谱差异,确认红花龙胆提取液灌胃后大鼠含药血清的移行成分。结果 在红花龙胆含药血清中发现20个入血成分,4个为原型成分,其余16个可能为原型成分代谢产物。结论 20个入血成分可能是红花龙胆的体内直接作用物质,对其进行深入研究可能有助于阐明红花龙胆的药效物质基础及药效机制。
Objective To explore the bioactive constituents of
中药血清药物化学是以药物化学的研究手段和方法为基础,分析鉴定中药口服后血清中移行成分,研究其药效相关性,确定中药药效物质基础并研究其体内过程的应用学科[1]。红花龙胆为龙胆科植物红花龙胆(
Agilent 1260高效液相色谱仪(DAD检测器);AY120型电子天平(梅特勒-托利多公司,感量:0.000 1 g);12620-840涡旋混合器(美国VWR公司);MCD-250RD低温高速离心机(日本ASONE公司);MTN-2800D氮吹浓缩装置(天津奥特塞恩斯仪器有限公司);eppendorf 移液器(德国)。
芒果苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111607-200402,含量:98.4%),供含量测定用。乙腈为色谱醇,甲醇、磷酸均为分析纯,乙醇为食用级,水为娃哈哈纯净水。红花龙胆药材采自贵州省贵阳市花溪,经贵阳中医学院魏升华副教授鉴定为红花龙胆(
SD大鼠,雌雄各半,体质量(200±20)g,购于第三军医大学实验动物中心,实验动物生产许可证号:SCXK(军)2012-0003。
1.4.1 对照品溶液的制备 取干燥至恒重的芒果苷对照品适量,加甲醇制成0.113 5 mg·mL-1对照品溶液。
1.4.2 红花龙胆药材供试液的制备 取红花龙胆药材,加10倍量50%乙醇回流2 h,滤过;滤渣用8倍量50%乙醇回流1 h。合并2次滤液,浓缩并转移至量瓶,加水定容至刻度,使含生药0.175 g·mL-1,密封,于4 ℃冰箱冷藏保存。
另取供试液100 μL,加甲醇定容至10 mL,过孔径0.45 μm微孔滤膜,供分析测试备用。
1.5.1 给药方案 取SD大鼠36只,按照体质量由轻到重顺序编号并划分为6个群体,按照随机数字表法随机分为6组,即空白对照组和5个给药组,每组6只。给药组按1.75 g·kg-1剂量灌胃给予红花龙胆提取物溶液,每天2次,连续3 d;空白对照组给予等量纯化水灌胃。末次给药前12 h禁食,自由饮水。
1.5.2 采血时间的确定 5个给药组末次给药后,分别于0.25,0.5,1,2,3 h用10%水合氯醛麻醉,经股动脉取血5 mL,全血静置凝结后,4 000 r·min-1离心15 min(
1.5.3 血清样本的预处理 分别取空白血清和含药血清各1 mL,加入甲醇3 mL,涡旋混合2 min,12 000 r·min-1离心20 min(
色谱条件:Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脱,0~5 min,92%→90.5%B;>5~20 min,90.5%→89.5%B,>20~45 min,89.5%→80%B;>45~80 min,80%→70%B;>80~90 min,70%→68%B;>90~100 min,68%→64%B;>100~105 min,64%B;流速0.8 mL·min-1;检测波长245 nm;柱温 25 ℃;进样量10 μL[5]。
2.1.1 精密度实验 取同批红花龙胆药材提取液1份,按“1.6”项色谱条件,连续进样6次,测得共有峰相对保留时间RSD均<1%,相对峰面积RSD均<3%,表明仪器精密度良好。
2.1.2 稳定性实验 精密吸取红花龙胆供试品溶液,按“1.6”项方法分别在0,3,6,9,12,24,48 h进样检测。其各共有峰相对保留时间RSD均<1%,相对峰面积RSD均<3%,表明样品在48 h内稳定。
2.1.3 重复性实验 取同批红花龙胆药材6份,制备供试品溶液,按“1.6”项色谱条件进样分析,记录色谱图,测得其各共有峰的相对保留时间RSD均<1%,相对峰面积RSD均<3%,表明该方法重复性良好。
2.2.1 成分分析 分别吸取红花龙胆提取物供试液、对照品溶液、含药血清、空白血清供试品溶液10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,并比较分析,确定红花龙胆口服吸收后的入血成分,见
通过比较红花龙胆灌胃液、含红花龙胆提取液血清、空白血清及芒果苷HPLC发现,除去血清中的固有成分(7号、14号),含红花龙胆血清中出现 20个移行成分,其中4个成分为红花龙胆药材原型成分,即11,12,13和22号峰,通过对照品对照及特征峰紫外光谱图,确认11号峰为芒果苷。其余各成分可能为大鼠口服红花龙胆提取液后在体内转化的代谢产物,各代谢物的鉴定和来源有待进一步研究。
实验中笔者对比了水煎、50%乙醇回流等提取方法,以50%乙醇溶液做提取溶剂时,色谱峰较多,能更好地反映红花龙胆药材的化学成分信息。对大鼠灌胃红花龙胆药材提取液后不同采血时间进行了对比研究,末次灌胃后30 min含药血清指纹图谱色谱峰较多,且峰形较好,峰面积较大。对甲醇和乙酸乙酯不同血清处理方法进行了对比研究,结果表明,甲醇处理含药血清后,能有效去除血清中的蛋白质等杂质,且操作简便,色谱图基线平稳、峰形较好。
芒果苷具有消炎、止咳作用,与红花龙胆药材的功效一致[5]。实验结果表明,其含药血清指纹图谱中,芒果苷以原型化合物入血,且红花龙胆药材指纹图谱中亦显示芒果苷含量较高。因此选择芒果苷作为红花龙胆药材质量控制指标可行,这为筛选确定红花龙胆的药效成分和质量标准的制订奠定了基础。红花龙胆中尚含马钱苷酸、獐牙菜苦苷、槲皮素、熊果酸、没食子酸乙酯等成分,仅马钱苷酸在部分批次药材中出现,其余均未检测到。在血清指纹图谱中上述成分均未检测到,可能是上述几种成分在红花龙胆药材中含量较少或检测条件限制,有待进一步研究。
本实验仅对红花龙胆提取液血清药物化学进行了初步研究,分析了245 nm波长处有吸收的情况,其余有无紫外吸收的成分尚待进一步研究;采用标准品对照,实验中仅确认了芒果苷一个原型成分,其余化合物尚需进一步研究。
The authors have declared that no competing interests exist.