Shimadu LC20A高效液相色谱仪(LC-20AD四元泵,SPD-M20A检测器,SIL-20A进样器 日本岛津公司),Agilent 1260 高效液相色谱仪(G1311C型四元泵,G1329B型进样器,G4212B型二极管阵列检测器,美国安捷伦公司),YOKO-2X紫外线分析仪(武汉药科新技术开发公司),KQ-500VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),CPA225D电子天平(德国赛多利斯,感量:0.01 mg),HHS-2S型电子恒温不锈钢水浴锅(上海宝蓝实验仪器制造有限公司)。

槲皮素对照品(批号:00081-201408,含量:99.1%)、山奈酚对照品(批号:110861-201310,含量:93.2%)、异鼠李素对照品(批号:110860-201410,含量:99.9%)、紫丁香苷对照品(批号:111574-200603,含量:98.9%)、人参皂苷Rb₁对照品(批号:140806-201509,含量:94.1%)、三七皂苷R₁对照品(批号:140534-201436,含量:97.7%)、大黄素对照品(批号:0922-201506,含量:99.9%)均购于中国食品药品检定研究院;银杏活脑胶囊(批准文号:鄂药制字Z20110124,湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院制剂室自制,批号:2015095,2016015,2016054)。

2.1.1 薄层系统的建立 展开剂:三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(5:10:5:1:2);薄层板:硅胶G薄层板;点样量:对照品溶液10 μL,供试品溶液及阴性样品溶液5 μL;显色条件:10%硫酸乙醇溶液,105 ℃加热至斑点显色清晰,日光和紫外光灯(365 nm)下检视。

2.1.2 供试品溶液的制备 取银杏活脑胶囊内容物2 g,加甲醇50 mL,超声提取45 min,滤过,蒸干,残渣加甲醇1 mL溶解,备用。

2.1.3 对照品溶液的制备 分别取紫丁香苷对照品、大黄素对照品、槲皮素对照品、人参皂苷Rb₁对照品及三七皂苷R₁对照品1.0,1.5,1.0,2.0,0.5 mg,使每毫升甲醇中分别含有以上对照品0.2,0.3,0.2,0.4,0.1 mg,作为混合对照品溶液,备用。

2.1.4 阴性样品的制备 根据银杏活脑胶囊的处方比例及制备方法,分别制备缺银杏叶提取物、何首乌、刺五加及三七阴性样品粉末,按照“2.1.2”项方法制备阴性样品,备用。

2.1.5 方法专属性实验 按照“2.1.2”项方法制备供试品溶液及阴性样品溶液,照薄层色谱法实验,吸取对照品溶液10 μL,供试品溶液及阴性样品溶液5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(5:10:5:1:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105 ℃加热至斑点显色清晰,置日光和紫外光灯(365 nm)下检视。结果见图1。通过色谱图可以看出供试品在5种样品相应位置上,显相同颜色斑点,阴性样品无相应颜色斑点,由此可知该方法专属性较好。

2.1.6 稳定性实验 取“2.1.2”项银杏活脑胶囊供试品,按照“2.1.1”项系统方法,分别于供试品溶液制备后0,4,8,12,24 h点样,与紫丁香苷、大黄素、槲皮素、人参皂苷Rb₁及三七皂苷R₁混合对照品溶液进行对照,与对照品相应的位置显相同颜色的斑点,各阴性对照样品色谱在相应的位置上无相同颜色的斑点。测出各斑点的R_f值大小,计算RSD。结果待测各斑点R_f值的RSD值分别为1.3%,0.5%,0.9%,2.1%,0.8%,表明供试品溶液的稳定性良好。

2.1.7 重复性实验 取同一批号的银杏活脑胶囊(批号:2015095)内容物约2 g,按照“2.1.2”项方法制备6份平行供试品溶液,与紫丁香苷、大黄素、槲皮素、人参皂苷Rb₁及三七皂苷R₁混合对照品进行对照,在同块薄层板上供试品与对照品相应的位置显相同颜色的斑点,各阴性对照样品色谱在相应的位置上无相同颜色的斑点。计算各斑点的R_f值和RSD。结果待测各斑点R_f值的RSD值分别为2.3%,1.7%,1.2%,1.4%,0.4%,结果表明该系统的重复性较好。

2.2.1 HPLC系统的建立 色谱柱:Inertsil ODS-SP C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相及梯度:甲醇(A)-0.4%磷酸溶液(B),0~15 min,15%→25%A,>15~25 min,25%→35%A,>25~45 min,35%→55%A,>45~60 min,55%→80%A,>60~70 min,80%→100%A。流速:1 mL·min^-1,柱温:35 ℃,检测波长:254 nm。色谱图见图2。

2.2.2 供试品溶液的制备 取银杏活脑胶囊内容物约1 g,精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,精密称定,超声提取(功率500 W,频率45.80 kHz)45 min,取出,擦干瓶身表面的水,待冷却至室温后精密称定,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,过孔径0.45 μm微孔滤膜,即得供试品溶液。

2.2.3 混合对照品溶液的制备 精密称定对照品紫丁香苷(0.281 2 mg)、槲皮素(0.225 0 mg)、山奈酚(0.008 3 mg)、异鼠李素(0.091 3 mg)、大黄素(0.013 4 mg)和三七皂苷R₁ (0.036 0 mg),加甲醇制成每毫升分别含上述对照品0.028 1,0.022 5,0.008 3,0.009 1,0.001 3,0.003 6 mg混合标准品溶液,备用。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.3”项混合对照品溶液2,4,6,8,10,12 μL,注入高相液相色谱仪,测定紫丁香苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、大黄素和三七皂苷R₁的峰面积。以最小二乘法进行线性回归,得到各成分的回归方程以及线性范围,结果见表1。由表1可知,待测成分在相应的范围呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度实验 依据“2.2.1”项色谱条件,精密吸取混合对照品溶液10 μL,重复进样6次,记录各待测成分的峰面积,计算RSD。结果紫丁香苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、大黄素和三七皂苷R₁峰面积的RSD分别为2.0%,1.5%,1.3%,1.2%,1.9%,1.8%。结果表明该仪器的精密度较好。

2.2.6 稳定性实验 取银杏活脑胶囊(批号:2015095)内容物,按“2.2.2”项方法,制备供试品溶液,并依据“2.2.1”项色谱条件,分别于制样后0,2,4,8,12 h,吸取该供试品溶液10 μL,进样、测定,记录各待测成分峰面积,计算RSD。结果紫丁香苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、大黄素和三七皂苷R₁峰面积的RSD分别为0.8%,1.6%,0.4%,2.5%,1.6%,2.4%。结果表明供试品溶液在12 h内稳定性较好。

2.2.7 重复性实验 取同一批银杏活脑胶囊(批号:2015095)内容物6份,分别按“2.2.2”项方法,制备供试品溶液,并依据“2.2.1”项色谱条件进样,测定各待测成分峰面积,计算RSD。结果紫丁香苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、大黄素和三七皂苷R₁峰面积的RSD分别为2.3%,2.8%,0.8%,0.6%,0.4%,0.1%。结果表明该方法的重复性良好。

2.2.8 回收率实验 采用加样回收法,各取5 mL已知含量的样品6份,分别按照1:0.8,1:1,1:1.2加入混合对照品,依法制备供试品溶液。按“2.2.1”项色谱条件,精密吸取各供试品溶液10 μL,注入色谱仪,测定各待测成分峰面积,计算各待测成分的回收率和RSD。结果紫丁香苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、大黄素和三七皂苷R₁的平均加样回收率分别为98.6%,101.2%,103.3%,99.98%,96.55%,100.5%;RSD分别为1.5%,1.9%,1.6%,2.1%,0.8%,2.3%。结果显示该方法的准确度较高。

2.3.1 计算相对校正因子 以大黄素作为参比组分,按照“2.2.4”项所得各组分回归方程,分别计算紫丁香苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、大黄素和三七皂苷R₁与参比组分大黄素的相对校正因子,计算公式为:f_k/s=α_k/α_s(α为各组分回归方程的斜率,s为参比组分,k为其他待测组分)^[12],结果见表2。

2.3.2 相对校正因子的验证实验 按“2.2.3”项方法平行制备对照品溶液6份,每份对照品溶液进样6个不同体积,测定各待测组分的峰面积。以最小二乘法进行线性回归得到各组分的回归方程,根据“2.3.1”项计算方法计算紫丁香苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚和三七皂苷R₁与参比组分大黄素之间的相对校正因子,其结果分别为0.949 6,0.987 0,0.989 8,0.994 9,1.000 0;RSD分别为2.4%,1.7%,1.9%,1.5%,2.8%,结果表明相对校正因子的重复性较好。

2.3.3 相对校正因子的耐用性考察 ①不同高效液相色谱仪对相对校正因子的影响:分别采用Agilent 1260和Shimadu LC20A高效液相色谱系统测定各待测成分的相对校正因子。结果表明,紫丁香苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚和三七皂苷R₁与参比组分大黄素之间的相对校正因子的重现性良好,RSD为1.42%~2.69%。

②不同色谱柱对相对校正因子的影响:分别采用Inertsil ODS-SP C₁₈、Ameritech C₁₈、Accurasil C₁₈ 3种色谱柱测定各待测成分的相对校正因子。结果表明,紫丁香苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚和三七皂苷R₁与参比组分大黄素之间的相对校正因子的重现性良好,RSD为0.78%~2.03%。

③流速对相对因子的影响:采用Shimadu LC20A高效液相色谱仪分别测定了3个不同流速(0.8,1.0,1.2 mL·mL^-1)下各待测组分的相对校正因子,结果表明,紫丁香苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚和三七皂苷R₁与参比组分大黄素之间的相对校正因子的重现性良好,RSD为1.55%~2.13%。

④柱温对相对因子的影响:采用Shimadu LC20A高效液相色谱仪分别测定了3个不同色谱柱温(34,35,36 ℃)下各待测组分的相对校正因子,结果表明,紫丁香苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚和三七皂苷R₁与参比组分大黄素之间的相对校正因子重现性良好,RSD为0.89%~2.41%。

精密吸取“2.2.3”项混合对照品溶液,分别注入Agilent 1260和Shimadu LC20A高效液相色谱仪,分别采用Inertsil ODS-SP C₁₈、Ameritech C₁₈、Accurasil C₁₈3种不同色谱柱进行洗脱,测定并计算紫丁香苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素和三七皂苷R₁与参比组分大黄素之间的保留时间,结果见表3。通过计算RSD,结果表明不同色谱柱下各待测成分间的保留时间波动较小。

分别采用多成分同步测定外标法(A)与相对校正因子计算法(B)两种方法测定出各组分的含量,比较2种方法所得的结果,结果见表4。由表4可知,2种方法测得各待测组分含量的结果均无明显差异,相对误差较小(相对误差<5%),说明相对校正因子计算法测定银杏活脑胶囊多种化合物的可靠性较高。

本次研究从多成分、一系统的理念出发,探索银杏活脑胶囊薄层系统的最适条件。在探索过程中,考虑到该研究对象为中药复方制剂,成分复杂,选用对照药材分析较为麻烦,且不符合具体指标的评价,故笔者选用对照品作为评价指标,并且根据该方的药理作用,综合处方分析,进而选择了紫丁香苷、大黄素、槲皮素、人参皂苷Rb₁及三七皂苷R₁ 5种对照品。笔者分别选用甲醇和乙醇作为供试品制备的溶剂进行探究,根据每种待鉴成分的性质和其单一展开系统情况,总结分析初步拟定4种薄层流动相系统,分别是:三氯甲烷-甲醇,三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇,三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸,三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水,依次对以上4种系统进行不同比例的探索,最终确定以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(5:10:5:1:2)为最佳。根据不同成分的性质,综合显色条件,分别用稀硫酸溶液、2%三氯化铝乙醇溶液和10%硫酸乙醇溶液作为显色剂进行比较,结果确定10%硫酸乙醇溶液为最佳显色剂。通过验证实验显示该系统稳定性较好,重复性高,适用于银杏活脑胶囊的质量鉴别。

3.2.1 供试品溶液制备方法 考察待测组分中,紫丁香苷溶于水、乙醇和甲醇,槲皮素溶于甲醇,不溶于水,大黄素溶于甲醇和乙醇,不溶于水,三七皂苷R₁溶于甲醇。综合分析,采用正交实验分别对提取溶剂(甲醇、50%甲醇、乙醇)、提取方法(回流、超声、浸置)与提取时间(30,45,65 min)进行考察,最终得出最佳提取方法为以甲醇50 mL为溶剂,超声提取45 min。

3.2.2 最佳流动相的选择 首先笔者以单一组分进行进样分析,紫丁香苷的流动相为甲醇-水,槲皮素、山奈酚及异鼠李素的流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液,大黄素的流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液,三七皂苷R₁的流动相为乙腈-水,故笔者分别对以上4种系流动相进行分析,综合各种因素,并结合流动相比例选定甲醇-0.4%磷酸溶液作为最佳流动相系统。

3.2.3 最佳检测波长的确定 采用等吸收图和3D全波长数据采集方法,在190~400 nm范围内对样品溶液进行谱图信息分析,并分别选取203,215,254,265,285,306,350和385 nm8个不同波长进行比对考察,综合分析,在254~265 nm之间所有待测组分均有明显吸收,且大黄素和紫丁香苷分别在254和265 nm处有特征吸收,三七皂苷R₁在203 nm有特征吸收,但在此波长下末端吸收较强,不利于分析,在结合以大黄素为参比组分的情况下,最终确定以254 nm为最佳检测波长。

3.2.4 参比组分的选择 在各待测组分中,大黄素和紫丁香苷化学性质比较稳定,且对照品来源经济易得,二者作为参比组分均可。但在含量测定和相对校正因子计算含量时,紫丁香苷的波动范围较大,且峰面积远大于其他待测组分,可能导致计算过程中出现较大误差,故最终选择以大黄素为参比组分。

3.2.5 目标色谱峰的定位 笔者在本实验选择了Agilent 1260和Shimadu LC20A两种不同产品的高效液相色谱仪,分别采用Inertsil ODS-SP C₁₈、Ameritech C₁₈、Accurasil C₁₈3种不同色谱柱进行分析,以最简单有效的保留时间差法进行计算,结果显示在Shimadu LC20A高效液相色谱仪下,以Inertsil ODS-SP C₁₈色谱柱进行洗脱分析,采用保留时间差法计算可准确定位目标色谱峰。