十万分之一BP211D型电子天平(德国赛多利斯股份公司);HWS28型电热恒温水浴箱(上海恒科仪器有限公司);Agilent 1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);二级管阵列检测器(G1315B,安捷伦科技有限公司);KPQ-1200型超声波清洗器(1 200 W,40 kHz,广州科普有限公司)。

羌活对照药材(批号:120935-200405)、独活对照药材(批号:120940-200809)、防风对照药材(批号:120947-200907)、异欧前胡素对照品(批号:110827-201410,含量:99.7%)、羌活醇(批号:111820-201303,含量:99.8%)、乌头碱对照品(批号:110720-201111,含量:98.8%)均由中国食品药品检定研究院提供。风湿痹痛胶囊(本医院制剂,批号:14J02002,150304,150305)。乙腈为色谱纯,水为双重蒸馏水,其他试剂为分析纯。

2.1.1 羌活鉴别 取本品内容物2 g,加乙醇20 mL,超声提取30 min,滤过,滤液浓缩至1 mL,作为供试品溶液。另取羌活对照药材0.5 g,加乙醇10 mL,同法制成对照药材溶液。另按处方取缺羌活药材,制备缺羌活阴性样品,取阴性样品2 g,同法制成缺羌活阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(30~60 ℃)-乙醚-醋酸(10:10:0.5)为展开剂,展开,展距约8 cm,取出,晾干,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性样品无相应斑点。薄层色谱结果表明,其他药材对羌活鉴别无影响。见图1。

2.1.2 独活鉴别 取本品内容物2 g,加乙醇20 mL,超声提取30 min,滤过,滤液浓缩至1 mL,作为供试品溶液。另取独活对照药材0.5 g,加乙醇10 mL,同法制成对照药材溶液。另按处方取缺独活药材,制备缺独活阴性样品,取阴性样品2 g,同法制成缺独活阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(30~60 ℃)-乙醚-醋酸(10:10:0.5)为展开剂,展开约8 cm,取出,晾干,喷以8%磷钼酸乙醇溶液,在105 ℃烘约10 min,检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性样品无相应斑点。薄层色谱结果表明,其他药材对独活鉴别无影响。见图2。

2.1.3 防风的鉴别 取本品内容物5 g,加1%盐酸溶液10 mL,混匀后移入分液漏斗,加石油醚(60~90 ℃)10 mL,振摇提取,分取石油醚层,蒸干,残渣加乙醇1 mL溶解,作为供试品溶液。另取防风对照药材0.5 g,加乙醇10 mL,超声处理10 min,滤过,滤液浓缩至1 mL,作为对照药材溶液。另按处方取缺防风药材,制备阴性样品,取阴性样品5 g,同法制成缺防风阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90 ℃)-乙酸乙酯(8:2)为展开剂,展开约8 cm,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性样品无相应斑点。薄层色谱结果表明,其他药材对防风鉴别无影响。见图3。

取本品内容物10 g,置表面皿中,加氨试液4 mL,拌匀,放置2 h,加乙醚75 mL,振摇1 h,放置24 h,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。另取乌头碱对照品,加无水乙醇制成每毫升含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取供试品溶液12 μL、对照品溶液5 μL,分别点于同一以羧甲纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以苯-乙酸乙酯-二乙胺(14:4:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以改良的碘化铋钾试液。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点不出现斑点。乌头碱的含量满足《中华人民共和国药典》2010年版限量要求。见图4。

2.3.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈-水(41:59)为流动相,检测波长310 nm,流速为1.0 mL·min^-1,柱温30 ℃。理论板数按异欧前胡素峰计算应不低于3 000。

2.3.2 对照品贮备液 取异欧前胡素对照品18.40 mg精密称定,置100 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制得含异欧前胡素为183.448 μg· mL^-1的贮备液。

2.3.3 供试品溶液制备 取胶囊内容物5 g(相当于胶囊10粒),精密称定,置具塞三角瓶中,精密加入甲醇50 mL,称定质量,超声处理30 min,取出,放冷,再称定质量,以甲醇补足质量,摇匀,滤过,续滤液为供试品溶液。

2.3.4 阴性对照溶液 取不含羌活的阴性样品适量5.0 g,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.3.5 专属性实验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪,记录色谱图。可见在供试品溶液色谱中,与对照品溶液色谱相应位置上有相同保留时间的色谱峰,阴性对照溶液在此保留时间无相应色谱峰。实验结果表明该制剂中除羌活外的其他药材对异欧前胡素的含量测定没有干扰,阴性对照溶液未见异欧前胡素的色谱峰,该方法具有专属性(图5)。

2.3.6 线性关系考察 精密吸取对照品贮备液适量,制成含有异欧前胡素浓度分别为3.668 96,7.337 92,14.675 84,36.689 60,73.379 2,183.448 00 μg· mL^-1对照品溶液。依次注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,浓度(X)为横坐标,进行线性回归,得异欧前胡素回归方程为Y=21.004X-9.341 3,r=1.000 0(n=6),异欧前胡素浓度在3.668 96~183.448 00 μg· mL^-1范围内与其峰面积线性关系良好。

2.3.7 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,重复进样5次,测定峰面积。结果显示,异欧前胡素峰面积RSD=0.67%(n=5),表明高效液相色谱仪精密度良好。

2.3.8 稳定性实验 取同一供试品溶液,分别于第0,2,4,8,12,18 h进样,测定峰面积。结果显示,异欧前胡素峰面积RSD=1.94%(n=6),表明18 h内样品稳定性良好。

2.3.9 重复性实验 取同一批样品(批号:14J02002)6份各5.0 g,按供试品制备方法制备供试品溶液,测定峰面积。结果显示,样品中异欧前胡素平均含量分别为0.335 4 mg·g^-1,RSD为1.91%(n=6),该方法可重复。

2.3.10 加样回收率实验 分别精密称取已知含量样品(约3.0 g)6份(批号:14J02002),取其中5份分别精密加入对照品异欧前胡素0.917 24 mg,按供试品溶液制备方法制备溶液,测定含量,计算回收率。平均加样回收率为96.42%,RSD=2.64%。满足含量测定的回收率要求。见表1。

取3批样品各3.0 g,精密称定,分别按供试品制备方法制备样品溶液,测定峰面积,计算异欧前胡素含量。3批次样品每粒胶囊含异欧前胡素的量分别为0.167 5,0.162 2,0.172 9 mg。