AUW220D型双量程分析天平(感量:0.1 mg/0.01 mg,日本岛津公司);UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);FADT-801RC 自动溶出仪(上海富科思分析仪器有限公司)。

甲硝唑片原研参比制剂购自Zentiva公司(FLAGYL,规格:每片0.2 g,批号:16N0010);甲硝唑对照品购自中国食品药品检定研究院(含量:100%,批号:100191-201507)。水为双蒸水,盐酸、醋酸、醋酸钠、氢氧化钠、磷酸二氢钾均为分析纯。共收集到38个厂家生产的甲硝唑片各一批,规格均为每片0.2 g。见表1。

参考《日本橙皮书》溶出数据库和美国溶出方法数据库,确定甲硝唑片的溶出介质为水、pH值1.2,4.5,6.8溶液,并依据CFDA《普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较原则》(2016年第61号)溶出介质的制备方法进行配制^[2-5]。①水:采用双蒸水。② pH值1.2盐酸溶液:量取盐酸7.65 mL,加水稀释至1 000 mL。③ pH值4.5醋酸盐缓冲液:取2.99 g的醋酸钠与2 mol·L^-1 醋酸溶液[取冰醋酸120.0 g(114 mL)用水稀释至1 000 mL,摇匀,即得]14.0 mL,用水溶解并稀释至1 000 mL,摇匀,即得。④ pH值6.8磷酸盐缓冲液:取0 .2 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液250 mL,加0.2 mol·L^-1氢氧化钠溶液112 mL,用水稀释至1 000 mL,摇匀,即得。分别以900 mL水(37±0.5) ℃和上述3种溶液(37±0.5) ℃ 作为溶出介质。

精密称定4份甲硝唑对照品(每份10 mg),置50 mL量瓶中,分别加入适量双蒸水、pH值1.2盐酸溶液、pH值4.5醋酸盐缓冲液、pH值6.8磷酸盐缓冲液4种溶出介质,振摇溶解并定容至刻度。取各储备液用对应溶出介质稀释至0.005 01 mg·mL^-1,依照紫外分光光度法,在波长200~600 nm范围内扫描。将上述溶液在4种介质中的最大吸收波长,选定为检测波长(见图1)。分别量取储备液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL,置50 mL量瓶中,用相应的溶出介质稀释至刻度,摇匀,得一系列浓度的对照品溶液。以4种溶出介质作为空白溶剂,于相应检测波长处测定吸光度,以浓度(C)为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标得回归方程。4种溶出介质中的检测波长,以及相应条件下的吸光度与药物浓度计算所得的回归方程见表2。

取英国原研参比制剂用辅料(磷酸氢钙、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁)和乳糖、淀粉、微晶纤维素等常用片剂用辅料(硬脂酸镁的质量分数为1%,其余的辅料质量比均为1:1),分别振摇混悬于4种不同溶出介质中,滤过后得空白辅料溶液,于200~600 nm 波长范围内扫描,观察空白辅料溶液在各溶出介质甲硝唑对应检测波长处的吸光度。实验结果显示,甲硝唑片常用辅料在各溶出介质对应的检测波长处基本无紫外吸收,表明辅料对甲硝唑的测定无干扰。见图2。

取甲硝唑片,研碎成细粉,精密称取适量,精密加入相应的溶出介质溶解,得到浓度约为8 μg·mL^-1的溶液,于对应检测波长处测定吸光度。结果甲硝唑在4种溶出介质中百分含量的RSD分别为0.12%,0.15%,0.11%,0.12%(n=6),说明测定方法的重复性良好。

取“2.4”项下的供试品溶液分别于0,2,4,6,8 h在对应检测波长处测定吸光度。经计算,在4种溶出介质其吸光度的RSD分别为0.12%,0.15%,0.11%,0.12%(n=5),结果表明供试品溶液在8 h内稳定。

精密称取4份甲硝唑对照品(每份17 mg),分别置100 mL量瓶中,按原研制剂的处方比例加入其他各辅料,先用甲醇溶解2 mL,再分别加4种溶出介质稀释至刻度,摇匀,精密量取5 mL,置50 mL量瓶中。用相应的溶媒稀释至刻度,摇匀,分别精密量取该溶液4,5,6 mL,各3份,分别置10 mL量瓶中,用对应溶出介质稀释至刻度,摇匀(分别为溶出80%,100%,120%时的紫外测定浓度),依照紫外-可见分光光度法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则 0401)^[3],分别在各溶出介质对应检测波长处测定吸光度,计算平均回收率和RSD(n=9),结果见表3。4种溶出介质中甲硝唑的回收率RSD值均<2%,说明该方法准确度良好。

参考多国药典选用桨法测定,转速为50 r·min^-1,溶出介质为900 mL,每次取6片同时投入温度(37.0±0.1) ℃的脱气溶出介质中,于1,5,10,15,30,60,90 min 取样6 mL [同时补入(37.0±0.1) ℃同种介质6 mL]移液管精密量取2 mL续滤液,置25 mL量瓶中,用相应的溶出介质稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。取上述供试品溶液分别在相应检测波长处测定吸光度,计算各时间点的累积溶出百分率。

目前多采用非模型依赖法(model independent approaches)中的相似因子(f₂)法^[5]来评价溶出曲线的相似性,计算公式如下:

f 2 = 50 × lg 100 1 + ∑ i = 1 n T i - R i 2 n (1)

T_i代表i时间参比制剂累积溶出百分率,R_i表示i时间受试制剂累积溶出百分率,n为取样时间点的个数^[6]。一般认为f₂在50~100时,两种制剂的溶出曲线相似(若参比制剂与受试制剂在15 min内累积溶出率均达到 85%以上,则无需比较两种制剂溶出曲线,可直接判定为相似)^[8]。

在4种溶出介质中,参比制剂在15 min内的平均溶出量均低于85%,选用相似因子(f₂)来衡量两条溶出曲线的相似性。若在50≤f₂≤ 100时,则认为两种制剂的溶出曲线相似^[7]。在38家药企中,仅有4家、9家、3家和1家药企生产的甲硝唑片分别在pH值1.2,4.5,6.8和水4种溶出介质中的溶出曲线与英国参比制剂基本一致。实验结果表明,国内甲硝唑片在4种溶出介质中溶出行为均与英国参比制剂差异较大(英国原研参比制剂样品编号为MT00)。见表4,图3。