一测多评法测定重楼药材中4种皂苷类成分含量

徐赛华¹^,, 沈昱翔²^,

1.宁波市鄞州区第二医院药剂科,宁波 315192

2.安顺学院农学系,安顺 561000

XU Saihua¹^,, SHEN Yuxiang²^,

1.Department of Pharmacy, the Second Hospital of Yinzhou District,Ningbo City, Ningbo 315192,China

2. College of Agriculture, Anshun University,Anshun 561000,China

沈昱翔(1984-),男,广西横县人,讲师,硕士,研究方向:药用植物资源及中药材质量标准化。电话:0851-32214210,E-mail:sshenyuxiang@sina.com。

作者简介徐赛华(1985-),女,浙江象山人,主管中药师,学士,研究方向:中药饮片质量标准化。电话:0574-55662558,E-mail:247036246 @qq.com。

基金资助: 贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合KY字〔2016〕276号)

中图分类号: R282.71 文献标识码: B 文章编号: 1004-0781(2017)09-1029-05

摘要:

目的建立一测多评法测定重楼药材中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量。方法采用高效液相色谱法,Phenomenex Luna C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),乙腈-水为流动相梯度洗脱,检测波长203 nm,流速1.0 mL·min^-1,柱温25 ℃;以重楼皂苷Ⅶ为内参物,建立其与去重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ的相对校正因子,采用一测多评法和标准曲线法同时计算皂苷含量,并进行比较。结果重楼药材中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量分别为0~1.120%,0~0.421%,0~0.264%,0.109%~0.485%,一测多评法测定的结果与标准曲线法无明显差异(RSD<2.0%)。结论一测多评法操作简单,重复性好,可为重楼的质量标准修订提供参考。

关键词: 重楼 ; 一测多评 ; 校正因子,相对

Abstract:

Objective To establish a quality evaluation method for determination of paris saponinⅠ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ in paridis rhizhma by quantitative analysis of multi-components with single-marker (QAMS). Methods An HPLC method and a Phenomenex Luna C₁₈ column(4.6 mm×250 mm,5 μm)were used. The mobile phase was acetonitrile-water (48:52) at a flow rate of 1.0 mL·min^-1. The detection wavelength was 203 nm and column temperature was 25 ℃. Parissaponin Ⅶ was used as the internal reference substance. The relative correlation factors of parissaponinⅠ,Ⅱ,Ⅵ were calculated by standard curve method and QAMS. Results The QAMS method could be used for determination of four saponin components at the same time without significant difference as compared with the results of standard curve method (RSD<2.0%). Conclusion QAMS method is simple and reproducible, which can provide a reference for quality standard revision for paridis rhizhma.

Key words: Paridis rhizhma ; Quantitative analysis of multi-components with single-marker ; Correlation factors ,relative

重楼为百合科植物滇重楼[Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz]或华重楼[Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.) Hara]的干燥根茎,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效^[1],临床上常用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、蛇虫咬伤、跌扑伤痛、惊风抽搐等。重楼作为重要的中成药原料之一,广泛应用于云南白药、抗病毒颗粒等著名产品中。现代研究表明,重楼具有抗肿瘤^[2-3]、免疫调节^[4]、调节心脑血管^[5]、抗感染^[6]等多种作用,且其主要活性成为甾体皂苷类。《中华人民共和国药典》2015年版对重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量进行了限定,但建立的高效液相色谱(HPLC)法需要配制含重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等4个对照品溶液,操作繁琐,测试时间较长,检测成本较高,不利于重楼及含重楼制剂的投料分、中间体及成品的质量控制与检测。本研究建立同时测定重楼药材中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的一测多评含量方法,报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司),Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司),Waters 2695高效液相色谱仪(美国沃特世科技有限公司),赛多利斯BP211DAG电子天平(德国Sartorius,感量:0.1 mg)。

1.2 试药

重楼皂苷Ⅰ(批号:111590-201103),重楼皂苷Ⅱ(批号:111592-201203),重楼皂苷Ⅵ(批号:111591-200402),重楼皂苷Ⅶ(批号:111593-200402)均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯,水为重纯化水,其余试剂均为分析纯。重楼属植物种类较多,故药材样品均由安顺学院沈昱翔采集或收集带有地上部分新鲜植株,并鉴定为为百合科植物滇重楼[Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz]或华重楼[Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.) Hara]。根茎洗净、干燥待用。

2 方法与结果

2.1 一测多评法原理

一测多评法是根据化学成分在一定的范围内其物质的量(质量或浓度)与检测器响应成正比,即:W=FA。因此,在多指标质量评价时,以其中某一组分为参照,建立该组分与其他组分之间的相对校正因子F_k/s。F_k/s= $\begin{matrix} \frac{F_{k}}{F_{s}} \end{matrix}$ = $\begin{matrix} \frac{W_{k} / A_{k}}{W_{s} / A_{s}} \end{matrix}$ ,其中W_K:待测物质浓度;A_k:待测物质峰面积。W_s:对照物质浓度;A_s:对照物质峰面积。然后通过F_k/s计算待测物质含量W_k=F_k/s× $\begin{matrix} {\frac{W_{s} \times A_{k}}{A_{s}}}^{[7 - 8]} \end{matrix}$ 。

2.2 色谱条件

Phenomenex C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱,程序为0~40 min,A:30%→60%;>40%~50 min,检测波长为203 nm;流速为1.0 mL·min^-1;柱温为25 ℃^[1]。在选定条件下,各色谱峰与样品中其他组分色谱峰达基线分离,其理论板数(N)均大于4 000,见图1。

图1 重楼HPLC图谱
A.mixed control solution;B.sample solution of paridis rhizoma;1.paris saponin Ⅶ;2.paris saponin Ⅵ;3.paris saponinⅡ;4.paris saponinⅠ

Fig.1 HPLC chromatograms of paridis rhizoma

2.3 对照品溶液的制备

取重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ及重楼皂苷Ⅶ对照品适量,精密称定,加甲醇制成每毫升含重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ分别为0.409 7,0.412 0,0.410 8,0.456 0 mg的混合溶液,即得。

2.4 供试品溶液的制备

取重楼粉末(过孔径0.355 mm筛)约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入乙醇25 mL,称定质量,加热回流30 min,放冷,再称定质量,用乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.5 线性关系考察

精密吸取上述混合对照品溶液,分别进样2,4,6,8,10,12 μL,测定各色谱峰峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标,色谱峰峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。结果表明重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ分别在0.819 4~4.916 4,0.824 0~4.944 0,0.821 6~4.929 6,0.912 0~5.472 0 μg范围内线性关系良好,见表1。

化合物名称	回归方程	线性范围/μg	r
重楼皂苷Ⅰ	Y=388.20X+1.19	0.819 4~4.916 4	0.999 9
重楼皂苷Ⅱ	Y=369.32X+11.36	0.824 0~4.944 0	0.999 9
重楼皂苷Ⅵ	Y=387.71X+12.74	0.821 6~4.929 6	0.999 9
重楼皂苷Ⅶ	Y=304.94X+6.41	0.912 0~5.472 0	0.999 9

表1 重楼皂苷类成分的线性范围考察

Tab.1 Linear ranges of paris saponins

2.6 精密度实验

取同一份供试品溶液,连续进样6次,测定并记录重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的峰面积。结果各成分峰面积RSD分别为0.25%,0.38%,0.41%,0.12%,表明仪器的精密度良好。

2.7 重复性实验

取同一批样品(贵州普定)6份,分别按“2.4”项方法制备,进样10 μL,测定峰面积,计算含量。结果重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量RSD分别为1.32%,1.18%,1.03%,0.97%,表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性实验

取同一供试品溶液(贵州普定),分别于0,1,2,4,8,16,24 h进样10 μL,测定峰面积,计算含量。结果重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的RSD分别为1.91%,1.84%,1.75%,2.14%,表明在24 h内,供试品溶液稳定。

2.9 加样回收率实验

取6份同一批号已知含量的样品(贵州安顺)约0.25 g,精密称定,分别加入混合对照品溶液1 mL(重楼皂苷Ⅰ2.512 mg·mL^-1、重楼皂苷Ⅱ1.012 mg·mL^-1、重楼皂苷Ⅵ0.651 2 mg·mL^-1、重楼皂苷Ⅶ1.252 mg·mL^-1)。按“2.4”项方法制备,进样10 μL,测定峰面积,计算回收率,结果表明4种重楼皂苷类成分平均加样回收率分别为98.64%,97.95%,97.92%,98.04%;RSD分别为2.26%,1.73%,1.76%,1.45%,说明该方法准确度良好,见表2。

表2 4种皂苷类成分加样回收率结果
Tab.2 Results of recovery test for four kinds of saponins

成分	取样量/ g	原有量			回收率
成分	取样量/ g	mg	%
重楼皂苷Ⅰ	0.251 2	2.813 9	2.512 0	5.240 8	96.61	98.64	2.26
	0.250 8	2.809 5	2.512 0	5.283 2	98.48
	0.252 4	2.827 4	2.512 0	5.275 4	97.45
	0.250 7	2.808 3	2.512 0	5.333 2	100.51
	0.253 2	2.836 3	2.512 0	5.401 2	102.11
	0.251 1	2.812 8	2.512 0	5.241 5	96.68
重楼皂苷Ⅱ	0.251 2	1.058 8	1.012 0	2.032 1	96.18	97.95	1.73
	0.250 8	1.057 1	1.012 0	2.078 4	100.92
	0.252 4	1.063 9	1.012 0	2.054 1	97.85
	0.250 7	1.056 7	1.012 0	2.048 6	98.01
	0.253 2	1.067 2	1.012 0	2.062 3	98.33
	0.251 1	1.058 4	1.012 0	2.034 3	96.43
重楼皂苷Ⅵ	0.251 2	0.662 7	0.651 2	1.295 8	97.22	97.92	1.76
	0.250 8	0.661 6	0.651 2	1.290 2	96.53
	0.252 4	0.665 8	0.651 2	1.301 5	97.62
	0.250 7	0.661 3	0.651 2	1.320 6	101.24
	0.253 2	0.667 9	0.651 2	1.298 4	96.82
	0.251 1	0.662 4	0.651 2	1.301 1	98.08
重楼皂苷Ⅶ	0.251 2	1.218 8	1.252 0	2.454 8	98.72	98.04	1.45
	0.250 8	1.216 9	1.252 0	2.421 3	96.20
	0.252 4	1.224 6	1.252 0	2.431 4	96.39
	0.250 7	1.216 4	1.252 0	2.445 8	98.19
	0.253 2	1.228 5	1.252 0	2.471 2	99.26
	0.251 1	1.218 3	1.252 0	2.463 5	99.46

表2 4种皂苷类成分加样回收率结果

Tab.2 Results of recovery test for four kinds of saponins

2.10 相对校正因子测定及耐用性考察

2.10.1 相对校正因子及相对保留时间测定取“2.3”项的混合对照品溶液,分别进样2,4,6,8,10,12 μL,测定峰面积。以重楼皂苷Ⅶ为参照物,计算各待测成分重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ相对校正因子F_Ⅰ/Ⅶ、F_Ⅱ/Ⅶ、F_Ⅵ/Ⅶ,相对保留时间t_Ⅰ/Ⅶ、t_Ⅱ/Ⅶ、t_Ⅵ/Ⅶ,结果见表3。

表3 相对校正因子及相对保留时间测定结果
Tab.3 Results of relative correction factor and relative retention time

编号	相对校正因子				相对保留时间
编号	F_Ⅰ/Ⅶ		F_Ⅱ/Ⅶ	F_Ⅵ/Ⅶ	t_Ⅰ/Ⅶ	t_Ⅱ/Ⅶ	t_Ⅵ/Ⅶ
1	0.874	1.029	0.753		1.603	1.463	1.119
2	0.878	1.037	0.757		1.602	1.462	1.118
3	0.880	1.039	0.759		1.601	1.461	1.119
4	0.869	1.023	0.746		1.601	1.461	1.118
5	0.872	1.026	0.749		1.602	1.462	1.118
6	0.875	1.032	0.751		1.601	1.461	1.119
平均值	0.875	1.031	0.753		1.602	1.462	1.119
RSD/%	0.46	0.60	0.65		0.05	0.06	0.05

表3 相对校正因子及相对保留时间测定结果

Tab.3 Results of relative correction factor and relative retention time

2.10.2 仪器对相对校正因子的影响取“2.3”项的混合对照品溶液,分别进样10 μL,比较3种不同型号高效液相色谱仪(Agilent 1200、Waters 2695、Shimadzu LC-20A)对相对校正因子的影响,结果见表4。F_Ⅰ/Ⅶ、F_Ⅱ/Ⅶ、F_Ⅵ/Ⅶ的RSD分别为1.19%,1.30%,1.83%,表明仪器对相对校正因子影响不大。

仪器型号	F_Ⅰ/Ⅶ	F_Ⅱ/Ⅶ	F_Ⅵ/Ⅶ
Agilent 1200	0.875	1.030	0.753
Shimadzu LC-20A	0.885	1.057	0.781
Waters 2695	0.896	1.042	0.765
平均值	0.885	1.043	0.766
RSD/%	1.19	1.30	1.83

表4 不同仪器对相对校正因子的影响

Tab.4 Influence of different instuments on relative correction factor n=3

2.10.3 色谱柱对相对校正因子影响取“2.3”项的混合对照品溶液,分别进样10 μL,在同一台高效液相色谱仪上(Shimadzu LC-20A),比较Phenomenex Luna、Agilent Eclipse、Diamonsil、Thermo、Kromasil 5种型号C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),结果见表5。F_Ⅰ/Ⅶ、F_Ⅱ/Ⅶ、F_Ⅵ/Ⅶ的RSD分别为0.93%和0.43%,0.80%,说明色谱柱对相对校正因子无显著影响。

色谱柱型号	F_Ⅰ/Ⅶ	F_Ⅱ/Ⅶ	F_Ⅵ/Ⅶ
Phenomenex Luna	0.875	1.030	0.753
Agilent Eclipse	0.878	1.034	0.758
Diamonsil	0.884	1.037	0.759
Thermo	0.863	1.028	0.747
Kromasil	0.869	1.026	0.746
平均值	0.874	1.031	0.753
RSD/%	0.93	0.43	0.80

表5 不同色谱柱对相对校正因子的影响

Tab.5 Influence of different chromatographic columns on relative correction factor n=3

2.11 样品测定

取不同产地的重楼药材,用本实验所确定的方法进行样品处理和成分定量测定,并分别采用一测多评法和标准曲线法计算含量,结果见表6。

表6 不同产地重楼的皂苷含量测定结果
Tab.6 Determination results of saponin content in paridis rhizoma from different habitats %,n=3

产地	重楼皂苷Ⅶ	重楼皂苷Ⅰ			重楼皂苷Ⅱ			重楼皂苷Ⅵ
产地	重楼皂苷Ⅶ	标准曲线法		一测多评法		标准曲线法	一测多评法	标准曲线法	一测多评法
贵州普定	0.485	1.120	1.122		0.421	0.422		0.264	0.263
贵州湄潭	0.182	0.145	0.146		-	-		0.102	0.102
贵州黔西	0.303	0.502	0.504		0.154	0.155		0.225	0.224
贵州晴隆	0.196	0.421	0.423		0.189	0.190		0.091	0.091
贵州清镇	0.251	0.426	0.428		-	-		0.193	0.192
云南巍山	0.159	0.643	0.646		0.355	0.356		0.124	0.124
云南鹤庆	0.223	0.453	0.454		0.156	0.157		-	-
云南曲靖	0.198	0.654	0.656		0.258	0.259		0.175	0.175
云南永平	0.259	0.321	0.322		0.143	0.144		0.198	0.197
湖南常德	0.275	-	-		-	-		0.201	0.200
四川彭州	0.199	0.655	0.657		0.225	0.226		0.137	0.137
湖北恩施	0.109	0.287	0.288		0.012	0.012		0.217	0.216

“-” means undetected

“-” 表示未检出

表6 不同产地重楼的皂苷含量测定结果

Tab.6 Determination results of saponin content in paridis rhizoma from different habitats %,n=3

由表6结果可知,不同产地重楼药材中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ的含量分别在0~1.120%,0~0.421%,0~0.264%,0.109%~0.485%范围内,不同产地、不同基原间含量差异较大。与标准曲线法测定结果比较,一测多评法测得去重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ含量无显著性差别,说明该方法测定结果具有较高可信度。

3 讨论

一测多评法是以样品中某一成分为内参物,建立该成分与其他成分间的相对响应因子,通过相对响应因子来计算其他成分含量的一种质量控制方法^[8-11]。该方法分析具有成本低、效率高等优点,能有效解决多指标质量控制面临的对照品短缺、不易获得和检测成本相对昂贵等问题,并收录于《中华人民共和国药典》2010及2015年版中。本实验建立了重楼药材的一测多评含量测定方法,并进行了该方法的耐用性、系统适应性考察,结果表明,该方法测定结果与标准曲线法一致,贴合中药多成分、多层次、多靶点的复杂特性,可为重楼及含重楼中药成方制剂的质量标准修订和提高提供参考。

本实验共采集12个产地重楼药材,其中滇重楼药材8批,华重楼4批。通过测定重楼药材中4种皂苷类成分含量,发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ受产地、基原影响较大,部分药材中未能检出这3种成分,而重楼皂苷Ⅶ较为稳定,在样品中均能检测,故选择其作为一测多评方法的内参物质具有较大的现实意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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[3]	颜璐璐,张艳军,高文远,等.滇重楼皂苷对10 种肿瘤细胞株的细胞毒谱及构效关系研究[J].中国中药杂志,2008,33(16):2057-2060. 滇重楼Paris polyphyllaSm ith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.为百合科重楼属植物的干燥根茎。重楼味苦,性微寒,有小毒,归肝经,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效,用于痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等。已有研究表明,重楼的水、甲醇和乙醇提取 DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2008.16.036 URL [本文引用:1]
[4]	胡文静,刘宝瑞,钱晓萍,等.重楼复方对荷 H22小鼠抑瘤及免疫功能的影响[J]现代肿瘤医学,2011,19(11):2175-2178. 目的：观察重楼复方（Chonglou Fufang,CLFF）对小鼠H22肝癌的抑制作用及其免疫调节作用。方法：建立小鼠肝癌H22实体瘤模型,将小鼠随机分为6组：空白对照组、CLFF 高、中、低剂量组、环磷酰胺（Cyclo-phosphamide,CTX）组、复方斑蝥（Fufang Banmao,FFBM）组。各组连续灌胃给药10d。于末次给药后24h,断颈处死小鼠,剥离瘤体,无菌条件下取脾脏,分别计算抑瘤率、脾指数,并采用 MTT显色法检测药物对细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）的细胞不良反应。结果：CLFF显著抑制肿瘤生长,高、中、低剂量组抑瘤率分别为54.84%、54.38%、 37.27%,与空白对照组比较具有显著性差异（P〈0.01）;CLFF高、中、低剂量组脾指数分别为（7.20±3.07）mg/g、（7.23±2.34）mg/g、（10.89±3.91）mg/g,各剂量组与环磷酰胺组比较具有显著性差异（P〈0.01）,中低剂量组与空白对照组比较具有统计学意义（P〈0.05）;CLFF高中低剂量组对小鼠的CTL细胞的杀伤率分别为51.76%、44.18%、22.74%,高剂量组与空白对照组及CTX组比较,P〈0.05,具有统计学意义。结论：CLFF具有显著抑制肿瘤作用,其抑瘤机制可能与其调节机体的免疫功能有关。 DOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2011.11.11 URL [本文引用:1]
[5]	胡静,钱晓萍,刘宝瑞,等.重楼醇提物体外抑制血管生成作用研究[J].现代肿瘤医学,2008,16(8):1273-1278. 目的：探讨重楼醇提物对体外血管生成的抑制作用及其可能的机制。方法：采用MTT法观察重楼醇提物对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）、人肠癌LOVO细胞增殖的影响。利用transwell小室趋化实验、体外管腔形成实验观察重楼醇提物对HUVEC迁移、成血管能力的影响。结果：重楼醇提物在（15—60）μg／ml浓度范围内，内皮细胞抑制率在24．2％-82．1％之间，具有抑制血管内皮细胞增殖作用；体外管腔形成实验发现，（15—60）μg／ml的重楼醇提物管腔形成数目减少，且管腔不完整，与对照组相比有显著性差异（P分别为0．0000011、0．0000417、0．0008752）。经（15—60）μg／m1的重楼醇提物处理后内皮细胞迁移数明显少于对照组（P分别为0．0000005、0．0000033、0．009993）。而在该浓度范围内，对人肠癌LOVO细胞无明显细胞毒作用（细胞抑制率在12．1％-13．9％之间）。（15—60）μg／ml的重楼醇提物可诱导内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞DNA的合成，且呈剂量依赖性（相关系数分别为0．929、-0．922，P为0．036、0．039）。结论：重楼醇提物在体外能有效抑制血管生成。其机制可能与抑制内皮细胞增生、迁移和管腔形成，诱导内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞DNA的合成有关。 DOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2008.08.005 URL [本文引用:1]
[6]	蒲秀瑛,刘宇,李言,等.重楼皂苷的制备及其抗 A 型流感病毒活性[J].中国药理学与毒理学杂志,2013,5(2):540-543. 目的研究重楼皂苷的制备及体内外对A型流感病毒(IAV)活性的影响。方法采用柱层析和反相液相色谱分离技术,从重楼中提取重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ和Ⅶ,应用高效液相色谱法测定其纯度。采用MTT比色法测定重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ和Ⅶ的细胞毒性,并检测其体外对IAV的直接灭活作用、对IAV吸附和侵入细胞的阻断作用及对IAV在靶细胞内增殖的抑制作用。用IAV滴鼻法制备IAV感染小鼠模型,模型制备4 h后分别每天ig给予重楼皂苷Ⅰ5和10 mg.kg-1及阳性对照药奥司他韦3 mg.kg-1,每天分2次给药,连续5 d,自给药后每天观察并记录小鼠发病情况和死亡数,共观察14 d,计算小鼠死亡率和生命延长率,评价其体内抗IAV作用。结果提取分离得到的重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ和Ⅶ的纯度分别为95.3%,90.2%,92.4%和86.8%。重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ和Ⅶ浓度分别低于 50,12.5,6.25和12.5 mg.L-1时,未见对靶细胞MDCK的细胞毒性。重楼皂苷Ⅰ6.25,12.5,25和50 mg.L-1,重楼皂苷Ⅱ6.25和12.5 mg.L-1,重楼皂苷Ⅵ3.13和6.25 mg.L-1,重楼皂苷Ⅶ6.25和12.5 mg.L-1及奥司他韦40 mg.L-1对IAV均有显著的直接灭活作用(P0.01),对IAV吸附和侵入靶细胞亦具有一定的阻断作用(P0.01),对IAV在靶细胞内的增殖具有抑制作用(P0.01)。重楼皂苷Ⅰ5和10 mg.L-1可明显降低IAV感染小鼠的死亡率(P0.01),由流感病毒感染组的8/10均下降到2/10;并可延长IAV感染小鼠的存活时间 (P0.01),存活时间由(8.5±0.3)d分别延长到12.7±0.4和(13.2±0.5)d(P0.01),生命延长率分别为49.4%和 55.3%,效果与奥司他韦近似。结论从植物重楼中分离到高纯度的重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ和Ⅶ,重楼皂苷Ⅱ,Ⅵ和Ⅶ在体外具有较好的抗IAV活性,重楼皂苷Ⅰ在体内外均具有较好的抗IAV活性。 DOI:10.3867/j.issn.1000-3002.2013.02.011 URL [本文引用:1]
[7]	刘云华,易进海,邵华武,等.替代对照品法同时测定川芎中丁苯酞和藁本内酯的含量[J].药物分析杂志,2012,32(5):758-762. 目的:建立HPLC替代对照品法同时测定川芎中丁苯酞和藳本内酯。方法:采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-水(52∶48)为流动相,流速1.0 mL.min-1,丁苯酞检测波长228 nm,藁本内酯检测波长330nm,柱温35℃。以丁苯酞作为藁本内酯的替代对照品,在不同条件下测定相对校正因子,利用相对校正因子和替代对照品同时测定川芎中丁苯酞和藁本内酯的含量。结果:丁苯酞和藁本内酯进样量分别在0.01～0.2μg(r=0.9999)和0.1～2.0μg(r=0.9999)范围内与峰面积呈良好的线性关系,测得相对校正因子f’为1.0806,不同条件下相对校正因子的重现性良好,利用相对校正因子计算川芎中待测成分含量与外标法实测值之间没有明显差异。结论:用丁苯酞替代藁本内酯作为对照品,同时测定川芎中丁苯酞及藁本内酯的含量,解决了藳本内酯对照品不稳定的难题,该方法可用于川芎的质量控制。 URL [本文引用:0]
[8]	王智民,高慧敏,付雪涛,等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志,2006,31(23):1925-1928. 目的：建立适合于中药特点的利用1个对照品同步测定多成分的分析方法，并建立其方法学的考察模式。方法：以木通为研究对象，以药材中典型成分皂苷PJ1（saponin PJ1）为指标，建立该成分与其他成分白木通皂苷B和白木通皂苷C（mutongsaponin B和C）间的相对校正因子，测定saponin PJ1的含量，用校正因子计算mutongsaponin B和C的含量；同时采用外标法实测药材中3种成分的绝对含量；采用夹角余弦法对一测多评法的计算值与外标法实测值进行比较。评价一测多评法的准确性和科学性。结果：建立了一测多评法方法学的考察模式；方法准确性评价结果表明一测多评法的计算值与外标法实测值之间没有显著性差异，实验所得的校正因子可信。结论：一测多评的研究思路在木通药材中得到验证，有望成为适合中药特点的多指标质量评价新模式。 DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2006.23.001 URL [本文引用:1]
[9]	冯伟红,王智民,张启伟,等.一测多评法测定秦皮药材与饮片中香豆素类成分的含量[J].中国中药杂志,2011,36(13):1782-1789. 目的:建立适合于中药特点的利用一个对照品同步测定中药中多种香豆素类成分的分析方法,并进行方法学考察.方法:以中药秦皮为研究对象,以药材中典型成分秦皮甲索(aesculin)为参照物,建立该成分与秦皮乙素(asculetin)、秦皮苷(fraxin)和秦皮素(fraxetin)的相对校正因子.采用外标法测定秦皮甲素,用校正因子计算秦皮中其他3种香豆素类成分的含量；并将一测多评法的计算值与外标法实测值用相对误差进行评价,以验证一测多评法的准确性和适用性.结果:秦皮香豆素一测多评法的计算结果与外标法的实测值之间没有显著性差异,实验所得的校正因子可信.结论:一测多评的质量评价模式在中药秦皮的多指标质量评价中得到验证,可为后续《中国药典》的品种修订提供参考. DOI:10.4268/cjcmm20111320 URL [本文引用:0]
[10]	吴珊珊,胡昌江,吕非非,等.一测多评法测定黄柏中5种生物碱[J].中成药,2014,36(1):130-134. 目的建立同时测定黄柏中5个成分(木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱)的一测多评法.方法以黄柏为研究对象,主要成分小檗碱为指标,建立小檗碱与其余成分之间的相对校正因子,并用该校正因子计算4种成分的量;用标准曲线法和一测多评法同时测定 30批黄柏药材和饮片中5种生物碱的量,以验证一测多评法的准确性和可行性.结果建立了黄柏中5种生物碱类成分一测多评法方法学的考察模式;对30批黄柏药材和饮片中5种生物碱的量用一测多评法进行测定,其计算值与实测值间无显著差异 (RSD＜5％).结论该方法操作简单、专属性和重复性良好,在对照品缺乏的情况下,可以作为一个新模式用于黄柏药材的多成分定量. DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.032 URL [本文引用:0]
[11]	宋丽萍. 一测多评法测定茵陈中4种酚酸类成分含量[J].中药材,2015,38(4):774-776. 目的：建立一测多评法测定茵陈中4种酚酸类成分的含量,并验证其准确性。方法：采用高效液相色谱法,色谱柱：AgilentZorbaxEclipsePlusC18（250mm×4.6mm,5μm）;流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B）,梯度洗脱;柱温30℃;检测波长324nm。以绿原酸为内参物,建立绿原酸与香草酸、咖啡酸和阿魏酸的相对校正因子,计算其他3种成分的含量,实现一测多评;同时采用外标法测定这4种酚酸类成分的含量,比较两者的差异。结果：采用校正因子计算含量和外标法测定含量之间无显著差异,RSD〈2.0%,实验所得的校正因子可信。结论：以绿原酸为内标,采用一测多评法可用于茵陈中酚酸类成分的质量控制。 DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2015.04.031 URL [本文引用:1]

2015

... 重楼为百合科植物滇重楼[Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz]或华重楼[Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.) Hara]的干燥根茎,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效^[1],临床上常用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、蛇虫咬伤、跌扑伤痛、惊风抽搐等.重楼作为重要的中成药原料之一,广泛应用于云南白药、抗病毒颗粒等著名产品中.现代研究表明,重楼具有抗肿瘤^[2-3]、免疫调节^[4]、调节心脑血管^[5]、抗感染^[6]等多种作用,且其主要活性成为甾体皂苷类.《中华人民共和国药典》2015年版对重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量进行了限定,但建立的高效液相色谱(HPLC)法需要配制含重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等4个对照品溶液,操作繁琐,测试时间较长,检测成本较高,不利于重楼及含重楼制剂的投料分、中间体及成品的质量控制与检测.本研究建立同时测定重楼药材中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的一测多评含量方法,报道如下. ...

... Phenomenex C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱,程序为0~40 min,A:30%→60%;>40%~50 min,检测波长为203 nm;流速为1.0 mL·min^-1;柱温为25 ℃^[1].在选定条件下,各色谱峰与样品中其他组分色谱峰达基线分离,其理论板数(N)均大于4 000,见图1. ...

天然甾体皂苷化合物的抗肿瘤活性

1999

滇重楼皂苷对10 种肿瘤细胞株的细胞毒谱及构效关系研究

2008

重楼复方对荷 H22小鼠抑瘤及免疫功能的影响

2011

重楼醇提物体外抑制血管生成作用研究

2008

重楼皂苷的制备及其抗 A 型流感病毒活性

2013

替代对照品法同时测定川芎中丁苯酞和藁本内酯的含量

2012

“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究

2006

... 一测多评法是以样品中某一成分为内参物,建立该成分与其他成分间的相对响应因子,通过相对响应因子来计算其他成分含量的一种质量控制方法^[8-11].该方法分析具有成本低、效率高等优点,能有效解决多指标质量控制面临的对照品短缺、不易获得和检测成本相对昂贵等问题,并收录于《中华人民共和国药典》2010及2015年版中.本实验建立了重楼药材的一测多评含量测定方法,并进行了该方法的耐用性、系统适应性考察,结果表明,该方法测定结果与标准曲线法一致,贴合中药多成分、多层次、多靶点的复杂特性,可为重楼及含重楼中药成方制剂的质量标准修订和提高提供参考. ...

一测多评法测定秦皮药材与饮片中香豆素类成分的含量

2011

一测多评法测定黄柏中5种生物碱

2014

一测多评法测定茵陈中4种酚酸类成分含量

2015