反相高效液相色谱法与荧光偏振免疫法测定血浆卡马西平浓度比较

白万军¹^,, 孙晓利², 安静¹, 宋浩静¹, 董占军¹^,

1.河北省人民医院药学部,石家庄 050051

2.河北医科大学第四医院药学部,石家庄 050017

BAI Wanjun¹^,, SUN Xiaoli², AN Jing¹, SONG Haojing¹, DONG Zhanjun¹^,

1.Department of Pharmacy, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051,China

2.Department of Pharmacy, the Fourth Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051,China

董占军(1967-),男,河北石家庄人,主任药师,硕士生导师,硕士,研究方向:临床药学。电话:0311-85988604,E-mail:13313213656@126.com。

作者简介白万军(1982-),男,陕西宝鸡人,主管药师,在读博士,研究方向:临床药学。电话:0311-85988640,E-mail:baiwanjun0311@163.com。

基金资助: 河北省2013年医学科学研究重点课题计划项目(20130409)

中图分类号: R971.6 文献标识码: B 文章编号: 1004-0781(2017)09-1043-04

摘要:

目的比较反相高效液相色谱(RP-HPLC)法与荧光偏振免疫(FPIA)法测定血浆卡马西平浓度的差异性和相关性。方法收集卡马西平血浆样本50例,分别采用RP-HPLC和FPIA进行测定,采用配对t检验比较两者均数的差异;Bland-Altman进行一致性分析;Deming回归法进行相关性分析。结果 FPIA法的测定结果高于RP-HPLC法,两种测定方法均数之间差异有统计学意义(P<0.05),一致性较差;Deming回归分析显示两种方法之间存在良好的相关性,回归方程为:C_FPIA=1.195 3C_RP-HPLC-0.144 0,Pearson相关系数为0.968 5。结论在制定卡马西平个体化给药方案时应充分考虑不同检测方法的影响,正确解读检测结果,提高个体化用药水平。

关键词: 卡马西平 ; 色谱法,高效液相,反相 ; 荧光偏振免疫法 ; 血药浓度

Abstract:

Objective To evaluate the correlation and difference of reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and fluorescence polarization immunoassay (FPIA) on determining serum concentration of carbamazepine. Methods Fifty serum samples were collected, both RP-HPLC and FPIA methods were employed to determine the concentration of carbamazepine.The results were analyzed by paired t test, Bland-Altman and Deming regression methods, respectively. Results The results of measuring 50 samples by the two methods showed that FPIA datas were significantly higher than RP-HPLC datas,and there was statistically significant difference(P<0.05) and poorer consistency between two methods; There was good correlation between carbamazepine concentrations determined by the two methods. Deming regression equation was C_FPIA=1.195 3 C_RP-HPLC-0.144 0, and Pearson correlation coefficient was 0.968 5. Conclusion Clinicians should pay more attention to the difference of carbamazepine concentration determination by different methods when carbamazepine individualized dosage regimen was adjusted according to therapeutic drug monitoring.

Key words: Carbamazepine ; Chromatography, high performance liquid, reversed phase ; Fluorescence polarization immunoassay ; Drug concentration in plasma

卡马西平是目前临床治疗癫的一线药物,其有效浓度范围为4~12 μg·mL^{-1 [1]},治疗窗窄,体内过程复杂,个体差异大。因此监测血浆卡马西平浓度为临床个体化精准医疗提供了直接依据。目前国内临床普遍使用的检测血浆卡马西平浓度的方法有荧光偏振免疫(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)法和反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法等。然而,不同检测方法之间由于测定原理不同,造成测定结果可能存在明显差异,对临床卡马西平血药浓度结果的解读造成不利影响,故比较不同检测方法之间的差异和相关性对临床个体化精准医疗具有重大的实用价值。因此,笔者将FPIA法和RP-HPLC法进行比较,考察两种方法间的差异及相关性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司);Waters2487紫外检测器(美国沃特世公司);Abbott Axsym System全自动分析仪(美国雅培制药有限公司);TOLED AB204-S电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司,感量:0.1 mg);UNIVERSAL 16R低温高速离心机(HETTICH ZENTRIFUGEN);XW-80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司);KQ3200E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);氮气吹干仪BF-2000M型。

1.2 试药

卡马西平对照品(中国食品药品检定研究院,批号:100142-201105);氯硝西泮(中国食品药品检定研究院,批号:171227-201103);卡马西平检测试剂盒(美国雅培公司,批号:2446M500);卡马西平标准曲线试剂盒(美国雅培公司,批号:22627M500);卡马西平质控试剂盒(美国雅培公司,批号:13554M500);甲醇(Fisher Scientific,批号:136910,色谱纯);乙腈(Fisher Scientific,批号:138080,色谱纯);实验用水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司,批号:20131108)。

2 方法与结果

2.1 RP-HPLC法

2.1.1 色谱条件色谱柱:SinoChorm ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm)。柱温:室温。流动相:乙腈-水(55:45)。流速:1.0 mL·min^-1。紫外检测波长:285 nm。进样量:20 μL。

2.1.2 标准溶液的配制精密称定卡马西平对照品10.0 mg,置于10 mL量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得1.0 mg·mL^-1储备液。冰箱(4 ℃)保存。精密称取氯硝西泮对照品10.0 mg,置于10 mL量瓶中,用甲醇配制成1.0 mg·mL^-1储备液,再用甲醇稀释成100 μg·mL^-1内标液,冰箱(4 ℃)保存。

2.1.3 血浆样品的配制及处理方法取离心管精密加入卡马西平标准溶液,氮气吹干后,精密加入血浆200 μL,配制成血浆中含有相应浓度的校正标准样品,再精密加入100 μg·mL^-1的内标液20 μL,涡旋30 s,加入甲醇600 μL,涡旋3 min,以1.609×10⁴ g、离心5 min,取上清液20 μL进样。

2.1.4 专属性实验在“2.1.1” 项色谱条件下,卡马西平和内标氯硝西泮能有效分离,峰形良好,保留时间分别约为5.3和6.3 min,无杂质干扰峰,基线平稳。

2.1.5 线性关系考察与最低检测限取离心管数支,配制成含0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0 μg·mL^-1的卡马西平血清样品,按照“2.1.3”项下操作,记录峰面积,用卡马西平峰面积与内标的峰面积比(Y)对样品浓度(X)做线性回归,得相应的标准曲线,得回归方程:Y=0.206X+0.004 22(R²=0.992 7)。显示卡马西平血清浓度在0.5~20.0 μg·mL^-1范围内线性良好。以信噪比=3:1计,卡马西平的最低检测限为0.1 μg·mL^-1。

2.1.6 精密度与准确度实验用空白血浆配制成含卡马西平浓度为1.0,5.0,15.0 μg·mL^-1的血清样品,平行制备5份,按“2.1.3” 项处理,连续测定3 d,分别计算日内精密度与日间精密度。结果见表1。

浓度/ ( μg·mL^-1)	精密度	准确度/ %
日内
1.0	1.0±0.1	9.1	-3.0
5.0	4.9±0.3	6.7	-2.2
15.0	15.1±0.9	5.8	-4.8
日间
1.0	0.9±0.1	6.5	-2.9
5.0	4.5±0.1	2.9	-3.0
15.0	13.9±1.3	9.3	-2.9

表1 卡马西平精密度与准确度

Tab.1 Accuracy and precision of carbamazepine assay

2.1.7 稳定性实验本研究考察了卡马西平血浆样品提取后室温放置12 h、反复冻融3次和-20 ℃放置7 d的稳定性。将上述低、中、高3个浓度的样品溶液,平行制备5份,分别按上述要求测定。结果见表2。

浓度/ ( μg·mL^-1)	计算浓度	准确度/ %
室温放置12 h
1.0	1.0±0.1	8.6	-3.0
5.0	4.9±0.2	4.8	-2.9
15.0	14.3±0.9	6.6	-4.4
3次冷冻解冻循环
1.0	1.0±0.1	9.1	-2.6
5.0	4.8±0.3	6.4	-3.8
15.0	15.1±0.9	5.8	0.4
-20 ℃放置7 d
1.0	1.0±0.1	8.3	-3.6
5.0	4.8±0.4	7.4	-3.8
15.0	14.1±0.4	3.1	-5.9

表2 卡马西平稳定性

Tab.2 Stability of carbamazepine assay ヌ±s

2.2 FPIA法

2.2.1 FPIA法标准曲线按照美国雅培公司Axsym全自动免疫分析系统的标准操作规范及试剂使用说明操作,用卡马西平相应试剂盒进行检测。分别取0.0,2.0,4.0,8.0,12.0,20.0 μg·mL^-1的标准溶液适量,进样测定,制备标准曲线,结果符合仪器要求。

2.2.2 FPIA法质量控制分别对3.0,6.0,16.0 μg·mL^-1质控样品进行考察,室内质控结果符合要求,结果见表3,表明FPIA法测定室内质控结果合格。

浓度	规定范围	测定值	准确度/ %
3.0	2.6~3.5	3.2	6.7
6.0	5.1~6.9	5.8	-3.3
16.0	13.9~18.1	16.5	3.1

表3 卡马西平室内质控样品测定

Tab.3 Detection on internal quality control sample of carbamazepine μg·mL^-1

通过测定卫生部临床检验中心全国血清治疗药物监测室间质量评价样品,结果见表4,成绩合格,说明FPIA法测定卡马西平室间质量评价结果合格。

样本	靶值	测定结果	允许范围	偏倚/ %	评价结果
1	1.9	1.9	1.4~2.4	0.00	通过
2	4.8	4.7	3.6~6.0	-2.08	通过
3	8.5	8.4	6.4~10.6	-1.18	通过
4	7.0	7.1	5.2~8.8	1.43	通过
5	3.6	3.6	2.7~4.5	0.00	通过

表4 卡马西平室间质量评价样品测定

Tab.4 Detection on external quality control sample of carbamazepine ng·mL^-1

2.3 质控样品比较分析

取卡马西平浓度为2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12.0,16.0 μg·mL^-1的质控样本,分别采用RP-HPLC与FPIA法测定,结果见表5。

样本	质控样本浓度	RP-HPLC法测得浓度	FPIA法测得浓度
1	2.0	1.6	1.9
2	3.0	2.7	3.1
3	4.0	3.9	4.1
4	6.0	5.6	6.4
5	8.0	8.2	8.4
6	12.0	12.8	13.3
7	16.0	15.4	16.9

表5 RP-HPLC法和FPIA法测定卡马西平质控样本的结果

Tab.5 Result of carbamazepine quality control samples determined by RP-HPLC and FPIA μg·mL^-1

将质控样本的真实结果、RP-HPLC法结果、FPIA法结果,分别进行配对t检验,结果差异无统计学意义(均P>0.05),说明RP-HPLC法与FPIA法在测定质控样本时均与质控真实结果无差异,二者均适用于患者卡马西平血药浓度的测定。

2.4 患者血浆样本比较分析

本研究方案经我院医学伦理委员会审核通过,患者均知情同意。收集我院治疗药物监测室接受卡马西平治疗的50例患者的稳态谷浓度血样,将分离得到的血浆分为2份,分别用RP-HPLC法与FPIA法测定药物的血药浓度。两种方法测定结果范围分别为0~11.8和0~9.6 μg·mL^-1,均数分别为6.6和5.6 μg·mL^-1;两组结果分别进行Kolmogorov-Smirnov检验,显示均服从正态分布;两样本配对t检验显示两种方法测定结果的均数差异有统计学意义(P<0.05);采用Bland-Altman一致性分析结果显示,FPIA法与RP-HPLC法差值均数为1.0 μg·mL^-1,一致性界限-0.6~2.5 μg·mL^-1,然而在Bland-Altman偏差图上,有8%(4/50)的点在95%一致性界限以外,>5%。因此,认为两种方法测定结果的一致性较差,FPIA法高于RP-HPLC法的测定结果。

进一步分析两种方法的相关性,FPIA法与RP-HPLC法测定50例患者的卡马西平血药浓度结果经过Deming回归分析(图1),回归方程为:C_FPIA=1.195 3 C_RP-HPLC-0.144 0,斜率和截距的95%置信区间为(1.111 9,1.278 6)和(-0.551 5,0.263 4),Pearson相关系数为0.968 5,上述结果说明两种方法测得的数据之间存在良好的线性关系。然而,此公式仅限于了解两种方法结果间的相关性,而不能在临床直接换算使用。

图1 FPIA法与RP-HPLC法测定卡马西平血药浓度的Deming回归分析

Fig.1 Deming regression of plasma carbamazepine concentrations determined by RP-HPLC and FPIA

3 讨论

FPIA系统测量分析物与抗体形成复合物时所发射的荧光偏振的变化量,此变化量与样品内所含分析物的浓度成反比^[2]。该法具有分析周期短、自动化程度高、操作简单等优点,因此,广泛用于临床药物、激素等的常规检测。当前国内应用FPIA原理检测卡马西平血药浓度的系统有TDx和AxSYM平台。然而,由于FPIA法本身采用免疫反应原理,存在交叉反应等固有影响,检测结果易受多种因素干扰。因此,对于卡马西平血药浓度的检测,国内已有多篇文献报道建立了专属性更高的HPLC法,并与FPIA法进行了比较^[3-5]。

但此类研究仅针对早期的TDx平台明确了FPIA与HPLC之间的显著差异,对于目前广泛运行的AxSYM平台的FPIA法与HPLC法之间的差异较少研究。本研究在AxSYM平台通过FPIA法和RP-HPLC法测定了50例患者的卡马西平血药浓度,发现FPIA法稍高于RP-HPLC法检测结果,两种方法之间差异有统计学意义(P<0.05)。

本研究结果发现在测定市售质控样品时,两种方法测定结果差异无统计学意义(P>0.05),然而,在测定患者临床样本时却发现两者差异有统计学意义(P<0.05)。这是因为质控样本成分单一,干扰成分少,极少受到交叉反应影响,而临床血浆样本成分复杂,如存在卡马西平活性代谢产物、内源性物质等^[4,6],由于其含有与卡马西平相似的结构导致发生交叉反应使FPIA

法测定结果偏高。RP-HPLC法采用现代色谱学原理,能从根本上排除交叉反应干扰,具有分离度好、专属性强等特点,尤其可同时测定多种抗癫痫药物浓度^[7],已作为临床血药浓度监测的常规方法应用。因此,临床医生在制定卡马西平个体化给药方案时应充分考虑不同检测方法的影响,正确解读检测结果,提高个体化用药水平。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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6种治疗药物监测结果回顾性分析

2014

... 卡马西平是目前临床治疗癫

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Abbott AxSYM全自动免疫分析仪工作原理及分析定标原理

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用HPLC和TDx法测定卡马西平血清浓度的相关性研究

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比较HPLC和FPIA法测定人血清中卡马西平的血药浓度

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... 法测定结果偏高.RP-HPLC法采用现代色谱学原理,能从根本上排除交叉反应干扰,具有分离度好、专属性强等特点,尤其可同时测定多种抗癫痫药物浓度^[7],已作为临床血药浓度监测的常规方法应用.因此,临床医生在制定卡马西平个体化给药方案时应充分考虑不同检测方法的影响,正确解读检测结果,提高个体化用药水平. ...

浓度/ ( μg·mL^-1)	精密度		准确度/ %
浓度/ ( μg·mL^-1)	平均浓度/ (μg·mL^-1)		RSD/ %
日内
1.0	1.0±0.1	9.1	-3.0
5.0	4.9±0.3	6.7	-2.2
15.0	15.1±0.9	5.8	-4.8
日间
1.0	0.9±0.1	6.5	-2.9
5.0	4.5±0.1	2.9	-3.0
15.0	13.9±1.3	9.3	-2.9