目的 探讨羌活中异欧前胡素在大鼠肠段的吸收特性。方法 建立大鼠体内单向肠灌流模型,以酚红为标示物,采用反相高效液相色谱法分别测定羌活粗提物中异欧前胡素的含量,并观察其与对照品在大鼠的肠内吸收情况。结果 羌活粗提物中异欧前胡素含量为(0.43±0.02)%(
Objective To study the absorption features of isoimperatorin in intestine of rat. Methods Establish a single-pass intestinal perfusion model of rat, take phenolsulfonphthalein as a marker for the detection of isoimperatorin concentration from crude extracts of notopterygium, and observe the absorption features of isoimperatorin and its reference substance in intestine of rat. Results The content of isoimperatorin in crude extracts was (0.43±0.02)% (
羌活是伞形科植物宽叶羌活(
SD大鼠,雄性,体质量(250 ± 25)g,由西安交通大学医学部动物实验中心提供,动物生产许可证号:SCXK(陕)2012-003。大鼠饲喂全价营养颗粒饲料,自由饮水,饲养环境温度18~29 ℃,相对湿度40%~70%,日光灯按大鼠昼夜节律调节。
异欧前胡素对照品购自中国食品药品检定研究院(批号:110827 - 200407);甲醇购自Fisher公司(色谱纯),其余试剂为国产分析纯;羌活药材购自武山县医药公司中药饮片厂,经鉴定为伞形科(Umbelliferae)植物羌活(
美国Waters公司高效液相色谱仪(包括Waters2996二极管阵列检测器,515型高压泵,Waters717自动进样器,Empower Pro色谱工作站);低温冷冻离心机(美国BECKMAN);电子分析天平(德国BA110S,感量:0.1 mg);UV-260型紫外分光光度计(日本SHIMADZU);KQ-300DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Millipore纯水机(美国MILLIPORE)。BT-100型恒流泵(上海青浦泸西仪器厂)。
1.4.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil C18反向柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流动相:甲醇:水=65:35;流速1 mL·min-1;在波长254 nm处进行检测。
1.4.2 K-R液和对照品溶液的配制 称取氯化钾 0.70 g,氯化钙 0.74 g,氯化钠 15.6 g,氯化镁0.04 g,磷酸二氢钠0.64 g和葡萄糖2.8 g,加纯化水1 500 mL,使其完全溶解,再加碳酸氢钠2.74 g,加水至2 000 mL,即得K-R液,现用现配。用分析天平称量异欧前胡素对照品10.00 mg,加适量甲醇超声溶解,转移至100 mL量瓶中,甲醇定容,得到浓度为100.00 μg·mL-1的异欧前胡素储备液。实验时,精密量取对照品储备液,加入适量聚山梨酯-80,超声混匀,用K-R灌流液(pH值7.4)定容至10 mL,制成0.10,0.50,2.5,5.0,10.0和12.5 μg·mL-1异欧前胡素对照品溶液。
1.4.3 酚红储备液 精密称量酚红20 mg,加入适量K-R液,超声溶解,定容至20 mL棕色量瓶,摇匀,4 ℃储藏。
1.4.4 灌流液的配制 取适量对照品储备液,加入适量酚红储备液和K-R液,再加入总体积1%的聚山梨酯-80,配制成酚红浓度为20 μg·mL-1的灌流液,超声混匀。
1.4.5 样品处理 收集大鼠灌肠的流出液涡旋混匀,取0.2 mL加入0.5 mL EP管,再加甲醇0.2 mL,涡旋30 s,4 ℃,12 000 r·min-1(
1.4.6 酚红校正灌流液体积的变化 取大鼠灌肠流出液0.5 mL,涡旋混匀,加入5 mL 浓度为0.2 mol·L-1的氢氧化钠(NaOH)溶液,涡旋30 s,3 000 r·min-1(
1.4.7 异欧前胡素和酚红标准曲线的建立 将“1.4.2”项中的0.10,0.50,2.5,5.0,10.0和12.5 μg·mL-1的异欧前胡素对照品溶液,按“1.4.1项”色谱条件进行HPLC分析,以质量浓度(
取适量酚红,精密称定,用K-R液稀释浓度为10,20,30,40,50,60 μg·mL-1的酚红溶液,紫外分光光度计(λmax=558 nm)测定吸光度值
1.4.8 精密度实验 配制0.3,1.0 和5.0 μg·mL-1 3种浓度的标准灌流液,由标准曲线计算各样品浓度,计算日内精密度;连续测定3 d,计算日间精密度(
1.4.9 重复性实验 按“1.4.4” 项方法,平行制备5份标准灌流液,测定并计算含量,相对标准偏差(RSD)为1.32%。
1.4.10 稳定性实验 制备浓度为2.50 μg·mL-1的标准灌流液,置于37 ℃水浴,流速0.2 mL·min-1,分别在0,1,2,4和8 h收集流出液,精密吸取10 μL进样,测定峰面积,并计算含量,RSD为0.37%。
1.4.11 回收率测定 选择在0.1~12.5 μg·mL-1范围内高、中、低浓度异欧前胡素对照品,量取1.1,1.3,1.5 mL对照品储备液加入空白肠循环K-R液中,每个梯度平行5份,按“1.4.1项”色谱条件测定,平均回收率为93.8%,RSD为1.01%(
1.4.12 含量测定 取药材羌活粉末5.00 g,加入70%乙醇500 mL回流提取2次,每次2 h,合并提取液,过滤,减压蒸馏回收溶剂,再将浓缩液水浴(65 ℃)蒸干,得羌活粗提物1.27 g。取适量干燥物,加聚山梨酯-80适量超声混匀后,用K-R液定容至100 mL量瓶中。取10 μL进样,按“1.4.1项”色谱条件测定,羌活中粗提物中异欧前胡素含量为(0.43±0.02)%(
1.5.1 大鼠单向肠灌流模型 取雄性SD大鼠,禁食12~18 h(不禁水),用20%乌拉坦(5 mL·kg-1)腹腔注射进行麻醉,沿腹中线剪开长3~4 cm的切口,小心分离十二指肠(距幽门1 cm处开始)、空肠(距幽门15 cm处开始)、回肠(自盲肠上行20 cm处开始)和结肠(从盲肠下端开始),约取10 cm,两端切口,插管并结扎,用37 ℃的0.9%氯化钠溶液将肠内容物冲净,再用空气将0.9%氯化钠溶液排净。取预热至37 ℃不同浓度的供试液以0.2 mL·min-1的流速平衡肠道30 min,每隔15 min分段收集流出液,共收集5次。最后剪取各灌流的肠段,测量肠内径及长度,计算灌流肠段的体积与灌流肠段的表面积。
1.5.2 数据处理与统计学方法 为改善因肠段在吸收药物时,分泌或吸收周围水分,所致药物浓度测定的准确性降低,本研究采用酚红法校正浓度,公式为:
采用SPSS13.0版软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(
验,以
将异欧前胡素储备液配制成5.0,1.0,0.3 μg·mL-1 3种浓度的供试液进行大鼠十二指肠单向肠灌流实验,结果见
统计学分析表明,异欧前胡素的浓度在十二指肠的有效渗透系数差异无统计学意义(
中浓度异欧前胡素供试液在不同肠段都有较高的渗透系数,表明异欧前胡素在小肠全肠吸收较好。统计分析显示,十二指肠、空肠和回肠部位渗透系数差异有统计学意义(
口服是最常用的给药途径,具有服用快捷方便、不适感小的特点。但很多药物口服后却存在胃肠道吸收差、生物利用度低等弊端。口服药物的主要吸收部位在小肠,对药物进行肠道吸收的研究是药物研制的重要步骤,本实验采用大鼠单向肠灌流法进行异欧前胡素的肠道吸收研究,为其口服制剂的研制提供参考。
与其他相关研究比较[11-12],本研究着重对比了羌活提取物粗品异欧前胡素与异欧前胡素对照品在大鼠各肠段的吸收,结果发现,羌活中粗品异欧前胡素
本研究显示,羌活粗品中异欧前胡素相比异欧前胡素对照品在各肠段均有更好的吸收,如果实验大鼠的样本量更多或进行多中心的实验,则实验的重复性更佳。同时,如果实验能够加入其他含异欧前胡素的植物,如白芷等,则可以判断是羌活中的粗提物具有促进吸收的效果还是其他植物中亦有该效果。
总之,本实验结果表明,羌活粗提物中异欧前胡素比异欧前胡素对照品在不同肠段具有更好的吸收,未来在含有羌活的口服药物制剂中,可考虑使用粗提物以提高异欧前胡素口服制剂的生物利用度。
The authors have declared that no competing interests exist.