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HERALD OF MEDICINE, 2018, 37(1): 85-87
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2018.01.022
星点设计-效应面法优选徐长卿超临界二氧化碳萃取工艺*
Study on Optimization Supercritical CO2 Extraction Technology of Paniculate Swallowwort Root by Design-response Surface Method
杨全伟, 程璐, 张耕, 胡松

摘要:

目的 优选徐长卿超临界二氧化碳(CO2)提取工艺条件。方法 以丹皮酚提取量为考察指标,采用高效液相色谱法测定其丹皮酚的含量,采用星点设计-效应面法优选其提取条件。结果 优选工艺条件为萃取压力10.81 MPa,萃取温度为55 ℃,CO2流量为59.91 L·h-1,萃取时间为2.42 h。结论 优选工艺萃取徐长卿中丹皮酚含量较高,工艺稳定可行。

关键词: 徐长卿 ; 丹皮酚 ; 星点设计-效应面法 ; 萃取,二氧化碳,超临界 ; 色谱法,高效液相

Abstract:

Objective To optimize the supercritical CO2 extraction technology condition of radix cynanchi paniculati. Methods The paeonol extract was used as indexes.The content of paeonol was determined by high performance liquid chromatography method.The extraction condition was optimize tby design-response surface method. Results The optimum process conditions for the extraction pressure was 10.81 MPa,extraction temperature was 55 ℃,flow rate of CO2 was 59.91 L·h-1,extraction time was 2.42 h. Conclusion The content of paeonol with optimum extraction process of radix cynanchi paniculati is high,process is stable and feasible.

Key words: ; Paeonal ; Design-response surface method ; Extraction,CO, supercritical ; Chromatography ,high performance liquid

徐长卿来源于萝藦科植物徐长卿[Cynanchum paniculatum(Bge.)Kitag.]的根及根茎或带根全草,具有祛风化湿、止痛止痒作用,用于治疗风湿痹痛。丹皮酚(paeonal)是其中主要活性成分之一,徐长卿合剂已被我院开发成为院内制剂,采用水回流提取,以丹皮酚的提取量为指标来控制其质量。但由于丹皮酚属于挥发性成分,提取过程中温度较高,时间较长,使得丹皮酚的提取率较低,所以采用加热提取的方法有明显的缺陷,考虑到丹皮酚为脂溶性成分,且极性较小,适合采用超临界二氧化碳(CO2)流体萃取其成分,本实验采用该法来萃取丹皮酚,以期得到萃取丹皮酚的最佳工艺。

1 仪器与试药
1.1 仪器

超临界CO2 萃取机;Waters e2695型高效液相色谱仪;万分之一分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 试药

徐长卿药材(武汉天济医药有限公司),丹皮酚对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110708-200506),甲醇(色谱纯),水为双蒸水,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 实验因素

参考文献[1],设定固定萃取温度为55 ℃,针对萃取压力(MPa),CO2流量(L·h-1),萃取时间(h)3个影响因素,分别设置3个水平,以丹皮酚含量作为考察指标,采用星点设计-效应面进行工艺优选,因素水平见下表1。

表1 星点设计-效应面水平设计
Tab.1 Central composite-response surface design
因素水平 萃取压力
(X1)/MPa
CO2流量(X2)/
(L·h-1)
萃取时间
(X3)/h
1 10 20 1.0
2 15 40 2.0
3 20 60 3.0

表1 星点设计-效应面水平设计

Tab.1 Central composite-response surface design

2.2 丹皮酚含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为ODS HYPERSIC-C18柱(4.6 mm×200 mm,5 μm),流动相:甲醇:水(60:40);流速:1.0 mL·min-1,波长:274 nm,柱温:30 ℃,理论板数按丹皮酚峰计算不低于7 000[2]

2.2.2 溶液制备 对照品溶液的制备:精密称取丹皮酚对照品(批号110708-200506)0.010 23 g,用甲醇定容至100 mL量瓶中,得到母液,取上述母液,从母液对照品中精密吸取10 mL至25 mL量瓶中,得到浓度为40.92 μg·mL-1的对照品溶液,摇匀,即得(每毫升含40.92 μg)。

供试品溶液的制备:取徐长卿药材粗粉,分为15份,每份250 g,按上述实验,所得的超临界CO2萃取物,分别用20 mL甲醇超声溶解5 min,转移置100 mL量瓶中,用甲醇定容,摇匀,然后精密吸取溶液3 mL,置100 mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,再精密吸取1 mL置50 mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,即得。

2.2.3 方法专属性 吸取丹酚酸对照品溶液、供试品溶液,超临界CO2萃取徐长卿所制备的供试品溶液各20 μL,进样,检测,徐长卿药材溶液、丹皮酚对照品、供试品在约7.8 min出现丹皮酚色谱峰。

2.2.4 线性关系考察 精密称取“2.2.2”项中对照品溶液,然后依次从前一份对照品溶液中精密吸取10 mL溶液至25 mL量瓶中,依次得到浓度为16.368,6.547,2.619,1.048 μg·mL-1的对照品溶液,分别进样20 μL,测定峰面积,以峰面积、对照品浓度计算线性回归方程:Y=5 183 128.844 2X+27 111.02,r=0.999 9;表明丹皮酚在1.048~16.368 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度实验 取“2.2.4”项下40.92 μg·mL-1对照品溶液20 μL,注入高效液相色谱仪,连续进样6次,计算丹皮酚峰面积RSD=0.28%,表明仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性实验 吸取同一供试品溶液,在相同色谱条件下,分别于1,2,4,8,12,24 h进样20 μL,测定峰面积,计算丹皮酚峰面积RSD=1.25%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性实验 取同一批样品,按供试品溶液的制备方法平行制备6份,测定丹皮酚的含量,结果按药材含量计算,平均含量为3.56 mg·g-1,RSD值为1.34%,表明本法重复性良好。

2.2.8 加样回收率测定 取已知含量样品6份,用20 mL甲醇超声溶解5 min,转移至100 mL量瓶中,各精密加入适量的丹皮酚对照品,加甲醇定容,摇匀,然后精密吸取3 mL溶液,置100 mL量瓶中,甲醇定容,摇匀,再精密吸取1 mL置50 mL量瓶中,摇匀,即得,分别进样20 μL,测定并计算回收率,结果平均回收率为99.58%(RSD=1.98%),表明方法稳定可行。

2.2.9 供试品的测定 按表2的星点设计法进行实验,得到15个提取供试品,吸取1~15号供试品各20 μL,进样,检测,计算。

2.3 实验结果 见表2。

表2 星点设计-效应面超临界CO2萃取丹皮酚含量直观分析
Tab.2 Intuitive analysis on the content of paeonal extraced by supercritical CO2 extraction and using design-response surface method
实验号 萃取压力
(X1)/MPa
X2/
(L·h-1)
X3/
h
丹皮酚含量
(Y1)/mg
1 10 20 2 3.248
2 20 20 2 3.524
3 10 60 2 4.217
4 20 60 2 2.984
5 10 40 1 3.259
6 20 40 1 2.478
7 10 40 3 3.411
8 20 40 3 3.349
9 15 20 1 2.751
10 15 60 1 2.832
11 15 20 3 3.547
12 15 60 3 4.314
13 15 40 2 3.863
14 15 40 2 3.784
15 15 40 2 3.852

表2 星点设计-效应面超临界CO2萃取丹皮酚含量直观分析

Tab.2 Intuitive analysis on the content of paeonal extraced by supercritical CO2 extraction and using design-response surface method

2.4 模型拟合

根据实验结果,采用Design-Expert.V8.0.6.1版软件,以丹皮酚含量为Y,对所选的因素分别进行多元线性回归方程以及二次多项式拟合,分别得到回归方程:多元线性方程为Y=3.43-0.23X1+0.16X2+0.41X3(r=0.504 4,P=0.045 2);二次多项式方程为Y=3.83-0.23X1+0.16X2+0.41X3-0.38X1X2+0.18X1X3+0.17X2X3-0.29 X 1 2 -0.051 X 2 2 -0.42 X 3 2 (r=0.942 6,P=0.012 7)。

根据多元线性方程及二次多项式方程数据可以看出,二次多项式方程的r值更接近1,P<0.05,故二次多项式模型为最优效应模型。采用Design-Expert.V8.0.6.1版软件绘制丹皮酚含量与各因素的三维效应图和二维等高图,结果见图1。

图1 丹皮酚含量(Y)对X1X3的三维效应图(A)和二维等高图(B)

Fig.1 Diagram of three-dimensional effect chart(A)and two-dimensional contour(B) of paeonal content(Y)versus X1X3

2.5 效应面优化与评估

图1可知,丹皮酚含量(Y)随萃取压强的增加,含量逐渐减少;随CO2流量的增加而增加,随萃取时间的增加,含量逐渐增加。最终由软件计算得最佳提取工艺为萃取压强为10.81 MPa,CO2流量为59.91 L·h-1,萃取时间为2.42 h。

2.6 验证实验

称取3份徐长卿药材,按优选的超临界CO2萃取工艺方法即:萃取温度为55 ℃,萃取压强10.81 MPa,CO2流量为59.91 L·h-1,萃取时间为2.42 h,得3批样品(批号:150214,150215,150216),按供试品溶液制法所得溶液,按上述色谱条件测定,进样20 μL,结果3批样品丹皮酚按药材含量计算分别为4.349,4.278,4.296 mg·g-1

3 讨论

徐长卿的传统提取方法如水蒸气蒸馏、乙醇提取法等都需要较高温度来回收溶剂,提取率低,有效成分提取不完全或损失严重。采用超临界CO2提取可克服以上缺点,尤其适用于含脂溶性及挥发性成分较多的中药的提取,同时又避免有机溶剂的残留,对环境也没有污染。

萃取压力是提取过程重要的参数之一。实验表明,丹皮酚含量随萃取压力的升高而增加,但达到一定程度时如果继续增加压力,超临界CO2流体的介电常数就会增加,极性进一步增大,反而使得丹皮酚在超临界CO2流体中的溶解度开始降低,从而使丹皮酚的提取率有所降低。萃取温度对萃取物中丹皮酚提取率有显著影响,这主要是由丹皮酚的性质决定的。丹皮酚熔点低,易挥发,提取过程中温度越高、时间越长,丹皮酚的含量就越低,因此选择一个合适的萃取温度对挥发性药材的提取至关重要。本实验优选的萃取温度为55 ℃,比水蒸气蒸馏、乙醇提取等方法的提取温度低很多,可以避免有效物质的损失[3]。应用超临界萃取法是当前中草药有效成分提取的一个发展方向,具有广阔的应用前景,尤其适合于非极性或弱极性成分的提取。

本实验采用星点设计-效应面法进行徐长卿提取工艺的优选,可以优化正交设计和均匀设计在实验中水平选择上的精确度,使得优选的工艺参数更加细化,以弥补其他实验设计方法的大线条的缺点[4-8]。有报道采用正交设计来优选超临界CO2提取徐长卿中丹皮酚的工艺,结合本实验采用星点设计-效应面法进行工艺优选,使得超临界CO2提取徐长卿中丹皮酚的提取工艺更加全面,为实验参数的选择提供了更好的参考。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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20世纪70年代,超临界萃取技术已形成了一个独特的新的化工分离工艺,由于它的优越性,使得这项技术在天然药物提取上得到迅速发展,应用的范围和种类也不断扩宽.超临界萃取技术不仅在单味药化学成分提取分离方面有独特的优势,在中药复方成分研究、中药指纹图谱研究及中药质量标准研究等方面也被广泛应用,已成为中药研究领域必不可少的技术手段.
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星点设计和效应面优化法是近几年来国外药学工作者常用的实验设计和优化法,使用方便,优选条件预测性好,本文综述该法的原理及操作步骤,并对其优缺点进行讨论。
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目的综述优化药物制剂工艺的多种数据处理方法的研究进展。方法通过查阅国内外相关文献,在单指标数据处理方法的基础上,对多种数据处理方法进行比较、分析和总结。结果方差分析-多指标综合加权评分法、多元回归分析-效应面法、人工神经网络、多维空间三角形面积法等多指标的数据处理方法在优化药物制剂工艺中已得到广泛应用及有一定的适用范围。结论方差分析-多指标综合加权评分法、多元回归分析-效应面法、人工神经网络、多维空间三角形面积法、代谢动态数学模型等多指标数据处理方法都能揭示多因素多水平之间的规律,为优化药物制剂工艺提供可借鉴的参考。
DOI:10.11669/cpj.2013.16.003      Magsci    
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Design-response surface m...
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