目的 观察苦荞提取物灌胃后对小鼠体内乙醇代谢酶的影响,并探讨其可能机制。方法 以雄性昆明种小鼠为实验对象,设阴性对照组、小剂量苦荞组、中剂量苦荞组、大剂量苦荞组,2 h后取肝脏组织。一部分肝脏组织用于提mRNA,并用荧光实时定量qPCR技术检测与乙醇和乙醛代谢密切相关的4个酶,即乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)、过氧化物酶(POD)、细胞色素P4502E1(CYP2E1)的基因表达水平。另一部分组织则用相关的酶活性试剂盒检测上述4种酶活性的改变。结果 小、中、大剂量苦荞提取物不改变小鼠肝脏内ADH的基因表达水平,但中、大剂量组明显增加其活性;小、中、大剂量苦荞提取物均促进小鼠肝脏内ALDH的基因表达水平,且小、中剂量组明显增加其活性;小、中、大剂量苦荞提取物不改变小鼠肝脏内POD基因表达,但大剂量组增加其活性;小、中、大剂量苦荞提取物对肝脏CYP2E1酶的基因表达和活性均无明显影响。结论 苦荞可以促进酒精的代谢,加速酒精的排泄,起到解毒作用,并降低对各种细胞器和酶功能损伤的作用。
Objective To study the effects of
苦荞(
实验证明,苦荞能够有效降低人体内血脂、血糖[1,2,3,4],还具有抗氧化[5,6]、保护红细胞[6]、清除DPPH自由基[7]、保护大鼠脑缺血-再灌注损伤[8],对α-淀粉酶也有抑制作用[9]。目前,苦荞提取物已经广泛用于多种保健食品和保健酒的制备中。然而,苦荞提取物是否影响乙醇或乙醛在体内的代谢,笔者目前未见报道。本研究拟通过给不同剂量的苦荞提取物后小鼠肝脏内与乙醇和乙醛代谢密切相关的4个酶,即:乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、细胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)基因表达和活性的改变,来观察苦荞对酒精代谢的作用。
雄性清洁级成年昆明种小鼠,体质量18~22 g;均购自武汉生物制品研究所有限责任公司,证书编号:42009800001189。
苦荞提取物,黄色粉末,实验时取不同质量的苦荞提取物溶于相同剂量的0.9%氯化钠溶液,涡旋振荡,分别配制成不同浓度的苦荞混悬液。ADH、POD活性测定试剂盒均购自南京建成生物试剂公司,CYP2E1活性测定试剂盒购自上海杰美公司,ALDH活性测定试剂盒购自Biovision公司。ADH、ALDH、POD、CYP2E1引物均购自英潍捷基贸易有限公司。
EL204型天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,感量:0.01 mg];福马88000系列低温冰箱[美国热电(上海)科技仪器有限公司];ELx800型酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);SHZ-A型水浴恒温振荡器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
雄性清洁级成年昆明种小鼠40只,按体质量随机分为4组,即小剂量苦荞组(苦荞60 mg·kg-1),中剂量苦荞组(苦荞120 mg·kg-1),大剂量苦荞组(苦荞240 mg·kg-1),以及阴性对照组(0.9%氯化钠溶液),每组10只,灌胃2 h后,处死动物并取肝脏组织,于-80 ℃冰冻保存。
按试剂盒说明书操作,测定小鼠肝脏内ADH、ALDH、POD、CYP2E1活性。其中,ADH活性=吸光度值的变化量×反应液总体积/样本量/反应时间/待测样本蛋白浓度×1 000;POD活性=吸光度值的变化量×反应液总体积/样本量/反应时间/待测样本蛋白浓度×1 000;CYP2E1活性计算=实际吸光度值×反应液总体积×稀释倍数/样本量/反应时间/纳摩尔吸光度系数×1 000。荧光实时定量qPCR实验从上述小鼠肝脏组织提取mRNA,用Takara公司逆转录试剂盒逆转录成cDNA,通过设计引物和荧光实时定量qPCR实验技术,检测ADH、ALDH、POD和CYP2E1的表达。引物信息:ADH:Forward:TCTCAACTGGCTATGGCTCTG,Reverse:AAAAGTCCACCCCTCCGTC; POD:Forward:GACCTCAAAGTATCCAAAAGCA,Reverse:CAGCGACCAGATGAAGCAG; CYP2E1:Forward:CAGTAGCACCTCCTTGACAGC,Reverse:GCCACCCTCCTCCTCGTA; ALDH:Forward:CCTCAGGTGGATGAAACTC,Reverse:CTTCGCCCCTTCTTGTTG。
用SPSS V13.0版统计软件,采用各实验组与阴性对照组均数比较的方差分析对数据进行处理。以
结果显示,给予小、中、大剂量苦荞并没有改变小鼠肝脏内ADH、POD和肝脏CYP2E1酶的基因表达。3个剂量的苦荞均使小鼠肝脏内ALDH表达增加,差异有统计学意义(
在肝内乙醇有4条代谢途径:①ADH的乙醇氧化体系;②滑面内质网上的微粒体乙醇氧化酶系统(microsomal ethanol oxidizing system,MEOS);③烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶-POD体系;④黄嘌呤氧化酶-POD体系。在这4条代谢途径中又以前两种为主。通常,少量乙醇在肝脏中主要通过ADH氧化体系代谢。它在肝脏内先被ADH氧化成乙醛,然后被ALDH氧化成乙酸,最后分解为二氧化碳和水。而慢性习惯性饮酒时,其高血浓度的乙醇则可诱导CYP2E1活性参与乙醇代谢[10]。在这些代谢产物中,乙酸是乙醇被吸收后产生的唯一有营养价值的物质,它可以提供人体需要的热量,而各种途径产生的乙醛则可以损伤各种细胞器和酶的功能,同时又能够刺激免疫系统诱发免疫反应性肝损伤。另外,乙醛还可通过扩张血管、刺激呕吐中枢、敏化疼痛相关神经环路等,引起头痛、头胀、眼胀、神经痛、呕吐等“酒上头”症状。乙醇在肝细胞内通过CYP2E1和ADH介导的氧化反应产生很多自由基,对细胞内物质造成氧化损伤。故肝脏中的ADH、ALDH和CYP2E1是乙醇及其代谢产物乙醛代谢非常重要的3种酶。
由于乙醇“上头”是喝酒后立刻产生的快速反应,故本实验采用雄性昆明种小鼠的一部分肝脏组织用于提取mRNA,并用荧光实时定量qPCR技术检测与乙醇和乙醛代谢密切相关的4种酶,即:ADH、ALDH、POD、CYP2E1的基因表达水平。另一部分组织则用相关的酶活性试剂盒检测上述4种酶活性的改变。结果表明:小、中、大剂量苦荞不改变小鼠肝脏内ADH的表达,但中、大剂量组明显增加其活性;小、中、大剂量苦荞均促进小鼠肝脏内ALDH的表达,且小中剂量组明显增加其活性;小、中、大剂量苦荞不改变小鼠肝脏内POD基因表达,但大剂量组增加其活性;小、中、大剂量苦荞对肝脏CYP2E1酶的表达和活性无明显影响。
从上述结果可知,摄入苦荞提取物后会通过增加小鼠ADH的活性使乙醇代谢为乙醛的能力增强,同时ALDH活性的增加,使乙醛更快被代谢为乙酸,起到解毒作用,降低对各种细胞器和酶功能的损伤,也解除乙醛致头痛、头胀、眼胀、神经痛等“酒上头”症状。同时,大剂量苦荞也会通过增加肝脏内POD的活性进一步促进乙醇代谢为其他无毒物质,加速乙醇的排泄。
The authors have declared that no competing interests exist.