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HERALD OF MEDICINE, 2018, 37(4): 477-479
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2018.04.017
高效液相色谱法测定浙贝母配方颗粒中贝母素甲和贝母素乙的含量
何敏1,, 郭田2, 杜昕2, 姚建标2, 沈利君1,

摘要:

目的 建立测定浙贝母配方颗粒中贝母素甲、贝母素乙含量的高效液相色谱法方法。方法 采用DIKMA,Diamand-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈-水-二乙胺(70:30:0.03) 为流动相;以蒸发光散射检测器为检测器。理论板数按贝母素甲峰计算应不低于2 000。流动相流速为1 mL·min-1,柱温为30 ℃。结果 贝母素甲进样量在1.141 7~6.850 2 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 9),贝母素乙进样量在0.856 3~3.681 8 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 8)。平均回收率分别为贝母素甲103.7%、贝母素乙100.0%,RSD分别为1.8%,2.4%。结论 该方法准确度、重复性好,能较准确地评价浙贝母配方颗粒的质量。

关键词: 浙贝母 ; 贝母素甲 ; 贝母素乙 ; 配方颗粒 ; 色谱法 ; 高效液相

Abstract:

浙贝母是道地药材“浙八味”之一,为百合科植物浙贝母的干燥鳞茎,以金华磐安、宁波鄞州等为主产地。味苦性寒,归肺心经,有清热化痰止咳、解毒散结消肿之功效,用于风热咳嗽等症状[1]。浙贝母与川贝相比,强于通泄,适用于外感风热、痰火郁结引起的咳嗽,多适用于表邪之实证;川贝则强于清火润肺,药性缓和,最适用于虚证[2]。浙贝母因疗效好被临床广泛使用,然而,浙贝母药材含淀粉多,易生虫和发霉,存贮时间较短,需要一定的手段防腐防蛀,才能保证质量和药效。传统方法用硫磺熏制法进行加工,增加了有毒物质的含量,不利于药物安全使用[3]。利用现代技术,通过工艺将饮片制备成中药配方颗粒,有减少饮片储存过程中有效成分的损失及有毒物质的积累、降低加工存储及运输过程带来的经济损失及方便患者服用等优点。浙贝母的主要药用有效成分是生物碱[4],其中贝母素甲和贝母素乙含量较高,且具有抗胆碱活性和支气管松弛作用,是主要指标活性成分[5]。《中华人民共和国药典》评价浙贝母质量主要是通过测定贝母素甲和贝母素乙的总含量。笔者在本实验中建立了浙贝母配方颗粒中贝母素甲和贝母素乙含量测定的高效液相色谱法方法,为确定配方颗粒的质量标准,建立质控方法做铺垫[6,7]

1 仪器与试剂
1.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司);蒸发光散射检测器;XP26电子分析天平;BS210S电子分析天平;200L蒸汽加热夹层锅;RE501旋蒸仪;TN200小型提取浓缩机组;DZF-605型真空干燥箱;LGJ-50C型干法制粒机;DFY-500型粉碎机;筛网(孔径0.05 mm)。

1.2 试剂

贝母素甲对照品(批号:110750-201311,购于中国食品药品检定研究院);贝母素乙对照品(批号:110751-201110,购于中国食品药品检定研究院);浙贝母饮片(批号:14090305,1409350,14090506,160201),经浙江康恩贝制药股份有限公司艾文博士鉴定为《中华人民共和国药典》规定的浙贝母。

2 方法与结果
2.1 色谱条件

色谱柱为DIKMA,Diamand C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为乙腈-水-二乙胺(70:30:0.03);检测器为蒸发光散射检测器;理论板数按贝母素甲峰计算应不低于2 000;进样量对照品溶液5,10 μL;供试品溶液各10 μL。流动相流速为1 mL·min-1;柱温为30 ℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取贝母素甲对照品、贝母素乙对照品适量,精密称定,加甲醇制成每毫升含贝母素甲0.2 mg、贝母素乙0.15 mg的混合溶液,即得。

2.2.2 配方颗粒的制备 取浙贝母2 kg,加水煎煮2次,每次加8倍量水,每次煎煮1 h,滤过,滤液浓缩至相对密度约1.20(60 ℃),85 ℃减压干燥,粉碎,加乳糖适量,混匀,制得10批配方颗粒:14090305批药材制得两批颗粒批号为:21140423,20140424;1409350批药材制得两批颗粒批号为160405,160406;14090506批药材制得3批颗粒批号为:160322,160323,160324;160201批药材制得3批颗粒批号为:160413,160414,160421。该配方颗粒已获得研究试点,工艺、质量研究参照《中药配方颗粒管理暂行规定》及《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》(2015年第283号)要求,并开展了系统研究。

2.2.3 供试品溶液和阴性供试品溶液的制备 取上述颗粒,研细,取约2 g,精密称定,置烧瓶中,加浓氨试液4 mL浸润1 h,精密加入三氯甲烷-甲醇(4:1)的混合溶液40 mL,称定质量,混匀,置80 ℃水浴中加热回流2 h,放冷,再称定质量,加上述混合溶液补足减失的质量,滤过。精密量取续滤液10 mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇使溶解并转移至2 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。另取乳糖适量,按上述供试品溶液的方法制备,即得阴性供试品溶液。

2.3 专属性实验

取同一浙贝母配方颗粒样品(批号:20140423),阴性供试品和对照品溶液按“2.1” 色谱条件测定。结果表明,样品图谱与对照品图谱贝母素甲、贝母素乙相应位置有对应的色谱峰,阴性供试品符合要求。见图1。

图1 3种溶液高效液相色谱图
A.阴性供试品;B.对照品;C.供试品;1.贝母素甲;2.贝母素乙

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液5,10,15,20,25,30 mL,按“2.1”项色谱条件测定峰面积,以峰面积的对数(Y)对进样量的对数(X)进行回归处理,贝母素甲、贝母素乙对照品的回归方程分别为Y=1.305X+2.802(r=0.999 9)和Y=1.300X+2.747(r=0.999 8),线性范围分别为1.141 7~6.850 2和0.856 3~3.681 8μg。

2.5 精密度实验

取浙贝母配方颗粒(批号:20140423),按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件,重复进样6次,测定贝母素甲和贝母素乙峰面积的RSD值分别为0.7%和1.2%,表明精密度良好。

2.6 重复性实验

取浙贝母配方颗粒(批号:20140423),按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液6份,测得含量分别为0.062%和0.047%,RSD分别为2.6%和4.2%,表明重复性符合要求。

2.7 稳定性实验

取贝母素甲、贝母素乙对照品,按“2.1”项色谱条件,分别于0,2,4,6,8,10,12 h进样,测得贝母素甲和贝母素乙峰面积RSD分别为3.0%和4.5%,表明贝母素甲、贝母素乙在12 h内稳定。

2.8 回收率实验

取已知含量的同一批样品6份,每份取约1 g,精密称定,按“2.2.3”项下方法,制备供试品溶液,分别精密加入贝母素甲和贝母素乙对照品溶液,进样测定,计算回收率,结果贝母素甲、贝母素乙的平均回收率依次为103.7%,100.0%;RSD依次为1.8%,2.4%,均符合要求,说明方法的准确度良好。见表1。

表1 贝母素甲和贝母素乙加样回收率结果 n=6
成分 原有量 加入量 测得值 回收率/
%
mg
贝母素甲 0.603 0.518 1.140 103.7
0.571 0.518 1.124 106.8
0.573 0.518 1.098 101.4
0.570 0.518 1.109 104.1
0.573 0.518 1.102 102.1
0.549 0.518 1.087 103.9
贝母素乙 0.463 0.353 0.816 100.0
0.447 0.353 0.794 98.3
0.430 0.353 0.773 97.2
0.437 0.353 0.805 104.2
0.439 0.353 0.793 100.3
0.421 0.353 0.773 99.7

表1 贝母素甲和贝母素乙加样回收率结果 n=6

2.9 样品含量测定

取10批浙贝母配方颗粒,按“2.2.3”项下制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件操作,测定结果见表2。同一批药材提取制备配方颗粒,含量测定结果较接近,表明提取工艺相对稳定。

表2 样品含量测定结果 mg·g-1
颗粒批号 贝母素甲含量 贝母素甲含量
20140423 0.62 0.47
20140424 0.63 0.50
160405 0.66 0.50
160406 0.64 0.50
160322 0.69 0.55
160323 0.71 0.58
160324 0.70 0.55
160413 0.72 0.56
160414 0.73 0.56
160421 0.75 0.57

表2 样品含量测定结果 mg·g-1

3 讨论

中药配方颗粒通过模仿传统水提取浓缩工艺,增加现代干燥制粒技术,将药物有效成分富集于少量水溶性颗粒中,保证疗效的同时,方便临床应用,是一种新的用药形式,但其质量控制缺乏统一标准,限制了临床的应用和推广。为解决这一问题,笔者建立了贝母素甲、贝母素乙含量测定方法。

3.1 色谱条件的确定

浙贝母配方颗粒中,目前已知的可测成分为贝母素甲、贝母素乙,其对照品溶液最大吸收波长接近200 nm,且流动相中含二乙胺,采用紫外检测器测定含量,干扰比较严重,因此参考《中华人民共和国药典》浙贝母药材含测方法,选用蒸发光散射检测器检测,流动相为乙腈-水-二乙胺(70:30:0.03)。

3.2 制剂辅料的确定

研究发现,配方颗粒中如采用糊精作为辅料,则在蒸发光散射检测器检测中,容易对目标成分产生干扰,影响检测准确性。通过对不同辅料的考察发现,乳糖作为辅料,对本品中贝母素甲、贝母素乙的测定无干扰,且乳糖制粒成形性良好,故最终选择乳糖作为浙贝母配方颗粒的制剂辅料。

3.3 供试品制备方法考察

浙贝母配方颗粒采用传统水提工艺,因此参考《中华人民共和国药典》浙贝母药材含测方法中的供试品制备方法,采用氨水浸润1 h后,三氯甲烷-甲醇(4:1)的混合溶剂提取,方法简便,且有效成分提取完全。

3.4 检测方法验证

本研究对浙贝母配方颗粒中两种生物碱含测方法进行了完整方法学验证,并完成10批不同颗粒的检测,结果表明:本方法准确稳定,操作简便可行,可用于浙贝母配方颗粒的快速检测和质量控制。为了更全面评价浙贝母配方颗粒质量,后续还需进行其标准汤剂的特征图谱研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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Objective: Experiments were carried on to identify the pharmacodynamic differences between aqueous extracts and Ethanol Extractes from )induced by ammonium hydroxide in mice,the counts of cough induced by critic acid in guinea pigs. The expectorant activity was studied by testing the amount of phlegm secreted in mice and rats. The antiasthma effects were studied by the asthma time induced by acetylcholine chloride and histamine phosphate in guinea pigs. The dose of 5 in mice and 1.5 g·kg in guinea pig. The codeine phosphate saved as positive control on the dose of 25 mg·kg in mice and 20 mg·kg in guinea pigs. The dose offritillarias was 2 g·kg in mice and 1 g·kg in rat, the ammonium chloride saved as positive control on the dose of 1 g·kg. The dose of 5 fritillarias was 1.5 g·kg and the salbutamol sulfate saved as positive control on the dose of 4.5 mg·kg. Result: <0.05.The ethanol extracts of and cough times between the two groups was significant <0.05.The aqueous extractives and the composition of aqueous and ethanol extracts of <0.05. Conclusion: Aqueous extracts of F. unibracteata may be the expectorant effective constituent and the ethanol extractis of F. unibracteata may be the anti-tussive effective constituent.
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利用LC-LTQ-Orbitrap MS~n对浙贝母花、花蕾、茎、叶以及鳞茎中的生物碱和黄酮类成分进行鉴定。生物碱鉴定采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm)色谱柱,10 mmol·L~(-1)甲酸铵溶液-乙腈为流动相,梯度洗脱,正离子质谱检测模式;黄酮鉴定采用Agilent-Zorbax SB C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,0.2%乙酸-乙腈为流动相,负离子质谱检测模式。根据高分辨质谱提供的精确质量数和二级碎片离子信息,并结合文献报道,从浙贝母植株各部位中鉴定37个生物碱,主要包括7个生物碱(浙贝宁苷、贝母辛、贝母素甲、贝母素乙、去氢鄂贝啶碱或浙贝丙素、鄂贝啶碱或蒲贝素A、贝母辛氮氧化物)及同分异构体;同时鉴定了16个黄酮类成分,主要包括槲皮素、山柰酚及其苷。上述结果表明,浙贝母植株地上各部位与鳞茎所含的生物碱种类大致相同,且含有鳞茎中未检测到的黄酮类成分,具有一定的开发利用价值。
DOI:10.4268/cjcmm20161124      URL    
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目的探究蒸发光散射(ELSD)测定浙贝母中贝母素甲、贝母素乙含量的可行性。方法色谱柱:Agilent Hypersil BDS-C18(4.0mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈-水-二乙胺(65:35:0.03),ELSD检测器对浙贝母中贝母素甲、贝母素乙含量进行测定。结果来自金华磐安三批次样品贝母素甲平均百分含量为(0.124±0.07)%、贝母素乙平均百分含量为(0.061±0.004)%。结论 ELSD测定浙贝母中贝母素甲和贝母素乙,方法准确可靠,测定较为快捷。
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浙贝母
贝母素甲
贝母素乙
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沈利君