目的 建立回乳抑增颗粒的指纹图谱及质量标准。方法 通过高效液相色谱法(HPLC)建立回乳抑增颗粒的指纹图谱,采用薄层色谱法对回乳抑增颗粒中夏枯草、浙贝母进行定性鉴别,应用HPLC对迷迭香酸、大麦芽碱进行定量测定,按《中华人民共和国药典》2015年版一部要求对回乳抑增颗粒项下指标,性状、粒度、干燥失重、溶化性等进行检测。结果 薄层色谱斑点清晰,分离度良好,阴性样品无干扰;迷迭香酸浓度在18.0~450.8 mg·L-1范围内呈现良好的线性关系,
Objective To establish a fingerprint and quality standard for
复方回乳抑增一号作为我院使用多年的临床经验方,一直以来均用于治疗乳腺增生和高泌乳素血症,有很好的效果[1]。经过前期已完成的武汉市卫生计生委科研项目“回乳抑增一号治疗HPRL药效学研究(编号:WZ11C07)”发现和证实,回乳抑增一号具有回乳消胀、软坚散结、行气活血功效,能恢复卵巢功能,使机体激素恢复平衡,达到治愈乳腺增生的目的[2]。由于回乳抑增方药量过大,对其进行了处方优化的实验研究,利用乳腺增生和高泌乳素血症模型大鼠,通过观察血清激素结果和病理切片结果,筛选出最优处方[3,4]。优化后的回乳抑增方由夏枯草、生麦芽、浙贝母、玄参、牡蛎、山慈菇、淡昆布组成[3,4]。本实验将优化后的回乳抑增方制成颗粒剂,采用高效液相色谱(HPLC)建立指纹图谱,并对方中君药夏枯草和臣药浙贝母进行定性鉴别,对夏枯草中迷迭香酸和君药生麦芽中大麦芽碱进行定量测定,对回乳抑增颗粒项目指标粒度、干燥失重、溶化性等进行检测,从而更加全面的对回乳抑增颗粒进行质量标准研究,为临床有效控制其质量提供更加可靠的依据,为申请医院制剂再次注册奠定基础。
Dionex UltiMate 3000型系列高效液相色谱仪(美国Dionex公司);ZF-6型三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司);BT25S型电子分析天平[Sartorius(中国)公司,感量:0.01 mg];薄层玻璃层析缸(上海信宜仪器厂);硅胶G板;KQ-300E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
迷迭香酸对照品(批号:MUST-13110115,含量:98%),大麦芽碱对照品(批号:MUST-12082201,含量:95%),均购买于成都曼斯特生物科技有限公司;熊果酸对照品(批号:MUST-14020612,含量:98%),贝母甲素对照品(批号:MUST-14111111,含量:98%),均购买于成都曼斯特生物科技有限公司;夏枯草对照药材(批号:120933-201105,TLC法鉴别专用),浙贝母对照药材(批号:120972-200404,TLC法鉴别专用),均购买于中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈(TEDIA公司,色谱纯),环己烷、正丁醇、乙醇等试剂均为国产分析纯,纯净水由实验室超纯水机自制。优化后回乳抑增处方组成:生麦芽、夏枯草、玄参、浙贝母、昆布、牡蛎、山慈菇(各药材由湖北清大药业公司提供,经武汉市第三医院药学部吴金虎教授鉴定,符合2015年版《中华人民共和国药典》一部[7]规定)。
按处方比例称取药材,加入6倍40%乙醇,70 ℃回流提取3次,每次0.5 h。合并滤液,用70 ℃减压蒸馏(-100 kPa),至浸膏相对密度为1.35~1.40,转移至蒸发皿中,70 ℃减压干燥(-100 kPa)为干浸膏,用粉碎机打成细粉,过筛孔内径0.150 mm筛。将乳糖和糊精按2:1混合均匀后,用80%乙醇作为粘合剂,70 ℃烘干颗粒后,过筛孔内径2.00 mm筛,整粒。
2.2.1 供试品溶液的制备 称取本品5 g,研细,加入乙醇30 mL,超声处理20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1 mL使溶解,即得。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取熊果酸对照品1 mg,置2 mL棕色量瓶中,加入乙醇溶解稀释至刻度,制成0.5 g·L-1的对照品溶液。
2.2.3 对照药材溶液的制备 精密称取夏枯草对照药材0.5 g,加入乙醇10 mL,超声处理20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1 mL溶解,即得。
2.2.4 阴性对照品溶液的制备 按处方比例称取缺夏枯草的其他药材,按照成品的制法制成阴性样品溶液,称取本品5 g,按“2.2.1”项下制备方法制成阴性对照品溶液。
2.2.5 薄层鉴别实验 照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则)实验,吸取以上4种溶液各10 μL,点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸(20:5:8:0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷10%硫酸乙醇溶液,在100 ℃加热至斑点显色清晰,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与熊果酸对照品和夏枯草对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,而阴性色谱无干扰,见
2.3.1 供试品溶液的制备 取本品10 g,加氨水5 mL,搅拌,放置30 min,加三氯甲烷50 mL,超声处理2 h,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取贝母素甲对照品1 mg,置2 mL棕色量瓶中,加入甲醇溶解稀释至刻度,制成0.5 g·L-1的对照品溶液。
2.3.3 对照药材溶液的制备 精密称取浙贝母对照药材5 g,加氨水5 mL,搅拌,放置30 min,加三氯甲烷30 mL,超声处理2 h,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1 mL使溶解,作为对照药材溶液。
2.3.4 阴性对照品溶液的制备 按处方量取缺浙贝母的其他药材,按成品制法制成阴性样品溶液,取10 g,按“2.3.1”项下制备方法制成阴性对照溶液。
2.3.5 薄层鉴别实验 照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则)实验,吸取上述4种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(8:12:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以改良碘化铋钾试剂。供试品色谱中,在与对照品和对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,而阴性色谱无干扰。见
根据《中华人民共和国药典》2015年版四部通则颗粒剂的有关规定,对样品的粒度、干燥失重、溶化性、装量、装量差异、微生物限度进行相关检查。
2.4.1 粒度 参照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则双筛法测定,不能通过筛孔内径2.00 mm筛与能通过筛孔内径0.180 mm筛总和,不能超过15%。结果见
2.4.2 干燥失重测定 参照《中华人民共和国药典》2015版四部通则测定法进行测定,不能超过6%,结果见
2.4.3 溶化性测定 称取样品10 g,加热水200 mL,搅拌5 min,立即观察,颗粒全部溶化。经实验观察,3批样品均在5 min内溶化。
2.5.1 对照品溶液的制备 精密称取迷迭香酸对照品适量,以甲醇配制成浓度2.254 g·L-1的对照品溶液。
2.5.2 供试品溶液制备 取本品10 g,精密称定,置50 mL棕色容量瓶中,加甲醇40 mL,超声处理30 min,放冷,用甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液,作为供试品溶液。
2.5.3 阴性样品制备 按处方比例分别称取除夏枯草以外的其余药味,按照制备工艺制成缺夏枯草的阴性样品,按“2.5.2”项供试品溶液的制备方法操作,制成阴性样品溶液。
2.5.4 色谱条件 AcclaimTM 120 C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈(A):0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0~10 min,95%B~90%B;10~60 min,90%B~35%B;),流速1 mL·min-1,柱温25 ℃,检测波长270 nm,进样量20 μL。系统适应性见
2.5.5 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0.2,0.5,1.0,2.0,5.0 mL分别置于25 mL量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,摇匀。以浓度(
2.5.6 稳定性实验 精密吸取“2.5.2”项下供试品溶液,用0.2 μm的微孔滤膜过滤,按“2.5.4”项下色谱条件进行测试,分别于1,2,4,6,12,24 h各进样测定一次,结果迷迭香酸峰面积RSD分别为1.32%,表明该溶液24 h内稳定性良好。
2.5.7 精密度实验 精密吸取“2.5.2”项下供试品溶液,用0.2 μm的微孔滤膜滤过,按“2.5.4”项下色谱条件进行测试,重复进样6次,迷迭香酸峰面积RSD为0.73%,说明本方法精密度良好。
2.5.8 重复性实验 取同一批号样品6份,平行制备成供试品溶液,按“2.5.4”项下色谱条件测定,结果迷迭香酸RSD分别为2.44%,表明该方法重复性良好。
2.5.9 加样回收实验 精密量取已知含量的供试品6份各2 mg于10 mL容量瓶中,分为两组,加入“2.5.1”项下对照品溶液1.0,1.2 mL,按“2.5.4”项下色谱条件测定,计算迷迭香酸平均回收率为98.5%,RSD值为1.58%,表明回收率良好。
2.5.10 迷迭香酸含量的检测 将“2.5.2”项下供试品溶液于“2.5.2”项下色谱条件下进行检测,得出3批样品中迷迭香酸含量,见
2.6.1 对照品溶液的配制 精密称取大麦芽碱对照品适量,加入盐酸水溶液(pH值=2~3)适量,使之成浓度为150 mg·L-1的对照品贮备溶液。
2.6.2 供试品溶液的配制 精密称取本品10 g于50 mL容量瓶中,加入40%乙醇至刻度,称质量,超声30 min后放冷,再次称质量,用40%乙醇补足质量。过滤,滤液蒸干,残渣加入盐酸水溶液(pH值=2~3)溶解并稀释至25 mL,为供试品溶液。
2.6.3 阴性样品溶液制备 按处方比例分别称取除生麦芽以外的其余药味,按照制备工艺制成缺生麦芽的阴性样品,按“2.6.2”项供试品溶液的制备方法操作,制成阴性样品溶液。
2.6.4 色谱条件 Hordenine Phenomenex Luna C8(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为甲醇:0.05 mol·L-1磷酸二氢钾(三乙胺调pH=7.10)=5:95,流速1 mL·min-1,柱温25 ℃,检测波长220 nm,进样量20 μL。理论板数以大麦芽碱峰计不低于2 500。
2.6.5 线性关系考察 分别精密量取大麦芽碱对照品贮备液0.2,0.5,1,2,3,5 mL 置10 mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,按“2.6.4”项下方法测定,以纵坐标峰面积(
2.6.6 精密度实验 取同一供试品溶液,连续进样5次,记录大麦芽碱峰面积。结果供试品溶液的平均峰面积为34.124 2,RSD 为0.75%,表明仪器的精密度良好。
2.6.7 稳定性实验 取同一供试品溶液,在室温下分别于0,6,12,18,24 h进样,记录大麦芽碱峰面积。结果供试品溶液的平均峰面积为34.225 7,RSD为1.54%,表明样品溶液在24 h内稳定性良好。
2.6.8 重复性实验 取同一批号的样品6份,按“2.6.2”项下的样品溶液制备方法进行制备,测得大麦芽碱的平均含量为75.65 mg·g-1,RSD为2.42%(
2.6.9 回收率实验 精密称取已知含量的样品5 g 9份,置10 mL量瓶中,分别精密加入大麦芽碱对照品0.30,0.38,0.45 mg,按照“2.6.2”项下的样品溶液制备方法进行制备,用微孔滤膜滤过,进样20 μL,结果平均回收率96.9%,RSD为2.11%。
2.6.10 大麦芽碱含量的检测 将“2.6.2”项下供试品溶液于“2.6.4”项下色谱条件下进行检测,得出3批样品中大麦芽碱含量见
2.7.1 供试品的制备 称取回乳抑增颗粒10 g置于50 mL量瓶中,加入50%甲醇40 mL超声提取30 min,自然冷却,加入50%甲醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过。
2.7.2 色谱条件 AcclaimTM 120 C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈(A):0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0~10 min,95%B→90%B;10~60 min,90%B→35%B;),流速1 mL·min-1,柱温25 ℃,检测波长270 nm,进样量20 μL。
2.7.3 共有峰的标定 称取同一批一半处方量的药材,按“2.1”项方法制作样品10批,并按“2.7.1”项下方法制作供试品,按“2.7.2”项下色谱条件进行测定,在这些峰中,8号峰峰面积较大,归属确定为迷迭香酸,并且在不同批次样品中稳定存在,故选其为参照峰;其他各共有峰的相对保留时间(RRT)和相对峰面积(RPA)均参照8号峰测定值计算所得。结果显示,各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.0%,结果见
2.7.4 相似度评价 将所得的TXT格式的色谱图依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版》软件,输出10 批导入图谱的相似度,10批回乳抑增颗粒的HPLC 图谱的相似度在0.963~0.998。各样品结果见
本研究选择君药夏枯草中迷迭香酸和生麦芽中大麦芽碱含量控制化学成分。在有效化学部位不明的情况下,一般选用药材的主要成分作为含量控制指标。有文献报道,夏枯草中迷迭香酸为发挥功效的主要成分之一,因此选择迷迭香酸为控制含量的指标[5]。能有效治疗高泌乳素血症的生麦芽中发挥作用的成分为生物碱成分[6]。但是,具体的化学成分并不明确,因此选择了麦芽中的主要生物碱成分大麦芽碱作为含量测定的另一个指标。回乳抑增颗粒主要作用成分和部位还需进一步研究。
在大麦芽碱的含量测定中,发现C18色谱柱分离的大麦芽碱色谱峰峰型很差。因此选择C8柱作为分离大麦芽碱的色谱柱,且经过实验证明其峰型效果良好。指纹图谱相似度高,均大于0.9。但是这10批供试品每味药均使用同一批次的药材,并未对不同批次、不同产地和不同季节采收的药材进行研究,对于不同产地与季节采收的影响还将进一步的研究。
The authors have declared that no competing interests exist.