目的 观察芍药苷的镇痛作用与大鼠三叉神经节神经元上酸敏感离子通道(ASICs)的关系。方法 制备口面部5%甲醛炎性疼痛模型,通过大鼠自发痛行为评估芍药苷的镇痛作用;采用全细胞膜片钳技术,探讨芍药苷对大鼠三叉神经节神经元ASICs介导的H+激活电流(
Objective To investigate whether acid-sensing ion channels (ASICs) in rat trigeminal ganglion ( TG ) neurons was involved in the anti-nociceptive effects of paeoniflorin (Pae). Methods Rat orofacial formalin pain model was used to evaluate the anti-noceciptive effect of Pae.Whole-cell patch clamp technique was used to record proton-gated currents mediated by ASICs (
芍药苷(paeoniflorin,Pae)源于毛茛科植物芍药的根,是芍药的主要有效成分。该药具有扩张血管、解痉镇痛、抗炎等作用,但其作用机制未被完全阐明。研究表明,多个受体和离子通道可能是芍药苷发挥神经保护作用的靶点[1,2]。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是H+门控的阳离子通道,在外周神经系统,ASICs作为酸感受器参与痛觉产生与调制,也是笔者前期研究工作的主要靶点之一[3,4]。芍药苷是否能通过调控ASICs发挥镇痛作用,笔者尚未见研究报道。笔者在本研究运用行为学和全细胞膜片钳方法观察芍药苷镇痛作用与大鼠三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)神经元上ASICs关系,探讨其可能作用机制,以期为芍药苷用于临床疼痛治疗提供实验依据。
行为学和膜片钳实验均选用健康 SD 雄性大鼠,7~8周龄,体质量180~200 g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供[动物生产许可证号:医动字第 19-025号;实验动物合格证号:SCXK(鄂)2010-0007号],均自由饮食,饲养室温度(23±2)℃,光暗周期同昼夜周期,相对湿度 (60±5)%。
芍药苷购自南京替斯艾么中药研究所(淡黄色粉末,相对分子质量480.46,含量>98%,批号:TCM068-100316);腺苷A1受体拮抗剂1,3-二丙基-环戊黄嘌呤(8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine,DPCPX,批号:9A/70155,Tocris公司 ),ASICs拮抗剂阿米洛利(amiloride,批号:BCBB4202)、三磷酸腺苷镁(MgATP)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(4-[2-hydroxyethyl]-1-piperazineethanesulfonic acid,HEPES) 、 2-吗啉乙磺酸 (2-[
记录ASICs电流的电极内液组成成分(mmol·L-1):KCl 140,HEPES 10, MgCl2 2,二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA) 10,MgATP 2,用氢氧化钾(KOH)调整pH值为7.2~7.4。
Axon patch 200B型膜片钳放大器,P-97型微电极拉制仪和MP-285型微操纵器(美国Sutter 公司) ,Axiovert 200型倒置显微镜(德国Zeiss公司)。
采用随机数字表法,将大鼠分为5组,每组5只:对照组,模型组,阿米洛利组,芍药苷组,DPCPX+芍药苷组。造模前15 min,分别在上述各组大鼠右侧触须垫中央部位皮下注射0.9%氯化钠溶液(NS)、NS、阿米洛利(30 μg)、NS和DPCPX(10 μg)各50 μL;5 min后分别腹腔注射NS、NS、NS、芍药苷(50 mg·kg-1)和芍药苷(50 mg·kg-1)。芍药苷、阿米洛利和DPCPX于实验前用NS溶解。腹腔注射10 min后开始制作面部炎性疼痛模型,对照组利用微量注射器取NS 50 μL注射到大鼠右侧面部触须垫皮下,其余4组右侧面部皮下注射5% 甲醛50 μL。注射完毕后,立即将大鼠置有机玻璃观察箱 (30 cm×30 cm×30 cm),视频捕捉系统记录大鼠自发痛行为。以大鼠抓搔注射部位时间( s )作为衡量疼痛行为指标,以3 min 为一观察时段,连续记录45 min。
SD大鼠腹腔注射20%乌拉坦麻醉(1.2 g·kg-1),断头,迅速取出三叉神经节,置于冷无钙Hank’s平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS)。HBSS中冲洗2次,剪碎并加入木瓜蛋白酶150 μL、
采用全细胞膜片钳技术,在电压钳模式下记录酸敏感离子通道电流。微电极由微电极拉制器两步拉制而成,使其在充满电极内液后的电阻维持在2~5 MΩ。通过微操纵器控制电极使封接电阻达GΩ 后,轻施负压使细胞破膜,调节相应电容补偿,即可获得全细胞模式。实验过程中,细胞均钳制在-60 mV。信号采集频率10 kHz,滤波频率5 kHz,采样后数据应用Clampfit 8.2进行分析。给药通过快速换液装置的排管进行,管口距所记录的细胞约50 μm。
酸性液体作用的量效曲线用Hill方程拟合:
采用Sigmaplot 9.0版软件进行统计学分析,实验结果以均数±标准误表示,
为研究芍药苷对TG神经元上
单独应用芍药苷未诱导出电流。实验中预加100 μmol·L-1芍药苷5 min 后,再给予酸性外液(pH值5.9),结果发现,芍药苷对3种形态
在10~1000 μmol·L-1浓度范围内,随着芍药苷浓度增加,其对
联合应用腺苷A1受体特异性拮抗剂DPCPX ( 1 μmol·L-1) 时,DPCPX能部分逆转芍药苷 (100 μmol·L-1 ) 对
大鼠颌面部皮下注射甲醛 (5%,50 μL)可诱发典型双相(第一相:0~3 min,第二相:12~36 min)自发疼反应,见
笔者在本实验中发现,ASICs参与了5%甲醛溶液皮下注射诱发的头面部持续性疼痛反应,芍药苷可减轻该疼痛反应。组织酸化是致痛的原因之一,H+可通过激活外周伤害性感受器上的辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1)和ASICs产生疼痛[6]。研究报道芍药苷可抑制TRPV1介导的炎症因子释放,从而产生抗伤害性作用[7]。在全细胞膜片钳实验,笔者在细胞外液加入TRPV1特异性阻断剂CPZ,整个实验过程中都能观察到芍药苷对阿米洛利敏感的H+诱导电流的抑制作用,说明TG上的ASICs是芍药苷产生镇痛作用的新分子靶点。
在10~1000 μmol·L-1范围内,随着芍药苷浓度增加,芍药苷对TG神经元上的ASICs电流的抑制率也增加,呈现明显浓度依赖性。如
ASICs拮抗剂对口面部炎性疼痛有镇痛作用,提示ASICs 参与口面部炎性疼痛信息的产生和(或)传导。研究报道芍药苷可激活腺苷A1受体来产生神经保护作用[8,9,10]。腺苷A1受体在神经系统分布广泛,在三叉神经节中也存在大量A1受体[11,12]。本实验中,面部皮下注射A1受体拮抗剂DPCPX可部分阻断芍药苷镇痛效应,提示外周A1受体参与了芍药苷镇痛作用。此外,笔者还发现DPCPX可部分阻断芍药苷对ASICs电流抑制作用,表明TG神经元上A1受体是芍药苷发挥镇痛作用的靶点之一。
综上所述,芍药苷对口面部外周炎性痛的镇痛效应与其作用于A1受体进而下调TG神经元上ASICs的敏感性有关。本研究结果对阐明芍药苷的镇痛作用机制提供了一定的理论和实验依据。