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医药导报, 2019, 38(11): 1459-1462
doi: 10.3870/j.issn.1004-0781.2019.11.015
高效液相色谱法测定生附子中3种双酯型生物碱含量*
Determination of Three Diester Alkaloids in Lateral Roots of Aconitum carmichaelii Debx. by HPLC
杨海宁1,, 文瑾2, 孙筱林3, 王登才1, 张宇佳1, 郑稳生1,

摘要:

目的 建立高效液相色谱法同时测定生附子中3种双酯型生物碱含量的方法。方法 采用WondaSil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为60 mmol·L-1醋酸铵溶液,B为乙腈:四氢呋喃(9:1),梯度洗脱;流速为1.0 mL·min-1;检测波长235 nm;柱温35 ℃。结果 新乌头碱、次乌头碱、乌头碱线性范围分别为0.526~10.520 μg(r=0.999 7)、0.522~10.440 μg(r=0.999 5) 和0.108~2.160 μg(r=0.999 2),平均加样回收率103.90%(RSD=0.94%),96.67%(RSD=1.27%),102.62%(RSD=2.42%)。结论 该方法操作简单,准确度高,可用于附子中3种双酯型生物碱含量测定。

关键词: 生附子 ; 生物碱 ; 含量测定 ; 色谱法 ; 高效液相

Abstract:

Objective To establish a method for the determination of three kinds of diester alkaloids in lateral roots of Aconitum carmichaelii Debx. by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods The analysis was performed on WondaSil C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column.The mobile phase A was 60 mmol·L-1 ammonium acetate aqueous solution and mobile phase B was acetonitrile:tetrahydrofuran (9:1) with gradient elution at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 235 nm and column temperature was set at 35 ℃. Results The linear ranges of mesaconitine,hypaconitine and aconitine were 0.526-10.520 μg(r=0.999 7), 0.522-10.440 μg (r=0.999 5) and 0.108-2.160 μg (r=0.999 2), respectively.The average recovery rates were 103.90%(RSD=0.94%), 96.67%(RSD=1.27%), 102.62%(RSD=2.42%). Conclusion This method is simple, accurate and proper for simultaneous determination of three diester alkaloids in lateral roots of Aconitum carmichaelii Debx.

Key words: Lateral roots of Debx. ; Alkaloid ; Content determination ; Chromatography ; high performance liquid

附子是毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii Debx.)子根的加工品,每年六月下旬至八月下旬采挖,主产于四川、湖南、湖北等地,始载于《神农本草经》。附子味辛、甘,性大热,有毒,具有补火助阳、散寒止痛、回阳救逆之功效,自古以来就是医家常用之品,但其毒性较强,临床用之不当可能导致中毒或死亡。《中华人民共和国药典》2015年版规定,附子常用量3~15 g[1,2,3]。但火神派代表吴佩蘅在方剂中动辄使用百余克附子,病情严重者可加至200~400 g[4]。附子中所含有效成分与有毒物质均为二萜类生物碱类,其毒性主要作用于神经系统、肌肉组织和心脏。其中双酯型生物碱毒性最强,主要包括乌头碱、次乌头碱和新乌头碱,此3种生物碱含量高,特征性强,常作为含附子制剂的测定指标[5,6]。目前文献中对生物碱类物质的提取多采用氨水碱化样品,再用有机试剂进行提取,但该方法操作较繁琐,重复性差。笔者在本研究采用酸水提取附子中双酯型生物碱,提取率更高,操作更简单,重复性好,建立的同时测定3种双酯型生物碱的高效液相色谱法灵敏度高、操作简单、重复性好,可以用于生附子中3种双酯型的含量测定,可为生附子质量控制提供参考。

1 仪器与试药
1.1 仪器

普析L600型高效液相色谱仪(北京普析通用公司),检测器(北京普析通用公司,型号:L600-UV);色谱柱WondaSil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);XS105DU型电子天平(梅特勒-托利多仪器公司,感量:0.01 mg);BSA423S-CW型电子天平(北京塞多利斯科学仪器有限公司,感量:0.001 g);DTC-27型超声波清洗机(鼎泰生化科技设备制造有限公司)。

1.2 试药

生附子(济南三株医院提供,批号:171225,180108,180302;产地四川,经济南三株医院牛纪江主任医师鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根);乌头碱对照品(批号:17110910,含量98.01%)、次乌头碱对照品(批号:17111310,含量99.04%)、新乌头碱对照品(批号:MUST-17111010,含量98.12%)均由成都曼思特生物科技有限公司提供;乙腈(上海安谱实验科技股份有限公司,批号:G2781296,含量99.99%)、甲醇(赛默飞世尔科技有限公司,批号:175167,含量99.99%)、四氢呋喃(上海安谱实验科技股份有限公司,批号:V593K072,含量99.99%)、醋酸铵(北京伊诺凯科技有限公司,批号:KBCK706,含量97%)、盐酸(北京化工厂,批号:20150701,含量36%~38%)、其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 色谱条件

Wondasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) ;以60 mmol·L-1醋酸铵作为流动相A,以乙腈-四氢呋喃(9:1)为流动相B,梯度洗脱(0~50 min,26%→38%B),流速1.0 mL·min-1;柱温35 ℃; 波长235 nm;理论板数按乌头碱计算应≥3000,相邻两色谱峰分离度应>1.5。混合对照品、样品色谱图见图1。

图1 混合对照品附子HPLC谱图
A.混合对照品;B.生附子;1.新乌头碱;2.次乌头碱;3.乌头碱。

Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances and lateral roots of Aconitum carmichaelii Debx.
A.mixed reference substances; B.lateral roots of Aconitum carmichaelii Debx.;1.mesaconitine; 2.hypaconitine;3.aconitine.

2.2 对照品的制备

精密称取各对照品适量,用0.05%盐酸甲醇溶解,配成新乌头碱、次乌头碱、乌头碱(分别为0.526,0.522,0.108 mg·mL-1)混合对照品储备液。取该储备液1 mL,加0.05%盐酸甲醇至10 mL,定容,滤过,取20 μL进样。

2.3 供试品溶液的制备

取过筛孔内径0.15 mm(100目筛)生附子粉末1 g于具塞磨口锥形瓶中,精密加入1%盐酸10 mL,摇匀,超声处理30 min,放至室温,3000 r·min-1离心10 min(r=15.7 cm),取上清液,滤过,取20 μL进样。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2”项对照品储备溶液1,4,8,10,12,20 μL,分别进样测定峰面积,以对照品进样量为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。新乌头碱回归方程Y=1 063 519.314X-31 122.424(r= 0.999 7)。结果表明,在0.526~10.520 μg范围内,新乌头碱峰面积与进样量呈良好的线性关系;次乌头碱回归方程为Y=1 216 539.728X-34 643.270(r=0.999 5)。结果表明,在0.522~10.440 μg范围内,次乌头碱峰面积与进样量呈良好的线性关系;乌头碱回归方程为Y=1 190 920.635X-6 345.444(r=0.999 2)。结果表明,在0.108~2.160 μg范围内,乌头碱进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度考察

精密吸取混合对照品溶液20 μL,按上述色谱条件注入高效液相色谱仪,重复进样6次,记录色谱图。结果新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰面积的RSD 值分别2.97%,1.14%,2.39%,表明该色谱方法精密度良好。

2.6 加样回收率实验

精密称取已知含量的生附子药材粉末9份各1.000 g,分别精密加入新乌头碱、次乌头碱及乌头碱对照品溶液适量,使样品溶液中新乌头碱、次乌头碱及乌头碱含量为样品中相应物质含量的80%(3份)、100%(3份)、120%(3份)。照“2.3”项供试品溶液制备方法制备,照“2.1”项色谱条件测定3种双酯型生物碱含量,分别计算加样回收率及RSD值,结果见表1。

表1 3种双酯型生物碱加样回收率实验结果
Tab.1 Results of recovery test on three kinds of diester alkaloid
成分 称样量/
g
原有量 加入量 测得量 加样回收率 平均加样回收率 RSD
μg %
新乌头碱 1.000 622.9 480.8 1125.4 104.51
1.000 622.9 480.8 1127.9 105.03
1.000 622.9 480.8 1129.8 105.43
1.000 622.9 601.0 1249.7 104.29
1.000 622.9 601.0 1246.3 103.73 103.90 0.94
1.000 622.9 601.0 1240.5 102.76
1.000 622.9 721.2 1363.6 102.70
1.000 622.9 721.2 1366.7 103.13
1.000 622.9 721.2 1369.4 103.51
次乌头碱 1.000 657.9 521.8 1167.4 97.64
1.000 657.9 521.8 1165.1 97.20
1.000 657.9 521.8 1175.6 99.21
1.000 657.9 652.2 1288.7 96.72
1.000 657.9 652.2 1283.3 95.89 96.67 1.27
1.000 657.9 652.2 1286.9 96.44
1.000 657.9 782.6 1402.3 95.12
1.000 657.9 782.6 1408.6 95.92
1.000 657.9 782.6 1407.8 95.82
乌头碱 1.000 128.2 96.5 224.5 99.79
1.000 128.2 96.5 222.9 98.13
1.000 128.2 96.5 226.1 101.45
1.000 128.2 120.6 253.5 103.90
1.000 128.2 120.6 255.9 105.89 102.62 2.42
1.000 128.2 120.6 253.2 103.65
1.000 128.2 144.7 278.3 103.73
1.000 128.2 144.7 279.9 104.84
1.000 128.2 144.7 276.1 102.21

表1 3种双酯型生物碱加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery test on three kinds of diester alkaloid

2.7 稳定性实验

精密吸取同一样品,分别于0,2,4,8,10,24 h 注入高效液相色谱仪,检测相应双酯型生物碱的峰面积,新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰面积RSD值分别为2.95%,3.01%,2.08%。结果表明采用酸水提取的供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 重复性实验

分别精密称定同一批生附子粉末6份,每份1 g,照“2.3”项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进行测定,记录各色谱峰面积。测得新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的峰面积RSD值分别为2.3%,1.1%,1.3%,结果表明本方法测定3种双酯型生物碱含量重复性良好。

2.9 样品含量测定

取生附子3批,按“2.3”项方法制备供试品,按照“2.1”项色谱条件进行测定,结果见表2。

表2 样品含量测定结果
Tab.2 Results of content determination on samples μg·g-1
样品 平均含量
新乌头碱 次乌头碱 乌头碱
171225 689.2 698.2 139.7
180108 622.9 657.9 128.2
180302 402.7 457.2 78.1

表2 样品含量测定结果

Tab.2 Results of content determination on samples μg·g-1

3 讨论
3.1 提取方法考察

附子中生物碱除极少部分以游离状态存在外,大部分以生物碱盐的形式存在于植物细胞。《中华人民共和国药典》2015年版采用氨水碱化样品,将生物碱游离出来,再提取。但实际操作中笔者发现,采用该方法提取双酯型生物碱,含量明显低于酸水直接提取。笔者在本实验中还考察了不同有机溶剂对结果的影响,结果显示,采用三氯甲烷提取时三氯甲烷易挥发,实验操作困难,结果可重复性差;采用异丙醇:乙酸乙酯(1:1)提取重复性较好,但操作繁琐,提取率偏低,约为1%酸水提取率的75%。同时,笔者在本实验中还考察了酸用量对实验结果的影响,结果表明,在1%盐酸溶液中,乌头碱稳定性优于0.5%盐酸。因此,笔者选择1%酸水作为最终提取液。

3.2 液相色谱条件的选择

本实验中,笔者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氢呋喃-水等系统作为流动相的色谱情况。由于3种双酯型生物碱最佳检测波长约235 nm,采用甲醇-水系统时基线波动较大,不利于检测,而采用乙腈-水系统时可以有效避免基线波动,但乌头碱类生物碱属于含氮化合物,具有弱碱性,单纯使用乙腈-水系统会有拖尾峰出现,因此选择在水相中加入醋酸铵来改善峰型[7]。笔者在实验中发现,加入10 mmol·L-1醋酸铵时,仅对低浓度乌头碱峰形有改善作用,而随着乌头碱浓度增加,依然有拖尾,所以最终色谱条件选择60 mmol·L-1醋酸铵溶液作为水相。虽然乙腈-水-醋酸铵系统基线平稳,峰型较好,但3种双酯型生物碱分离度较差,调节流动相比例依然不能将其完全分离,而采用乙腈与四氢呋喃9:1混合作为有机相时,3种双酯型生物碱分离度良好。

3.3 附子的毒性及减毒

附子毒性主要来源于双酯型生物碱,且该类化合物对Na+通道的II位点具有高亲和力,其可增加Na+内流,进而引起心律失常,导致严重急性毒性(LD50约0.15 mg·kg-1)[8]。双酯型生物碱稳定性差,经炮制和煎煮可水解成苯甲酰类单酯型生物碱及原碱,且随煎煮时间的变化,其含量呈现一定规律变化。生成的单酯类生物碱活性较强且毒性显著降低[9,10,11]。因此,现在临床煎剂及中成药中一般选用制附子。附子的传统炮制解毒方式较多,包括去皮、炮、炒、煨、烧、黑豆制、蜜制、姜制等[12]。在此基础上,有学者利用先进的科学技术,摸索出附子炮制新工艺,如邓文伟等[13]采用烘箱烘烤法成功制备出质量合格的制附子,杨明等[14]采用微波炮制出药效好、毒性低的附子。附子与其他中药配伍也能在一定程度上减轻其毒性,例如与甘草配伍,甘草中羧酸可与附子中生物碱发生缔合作用生成沉淀,进而降低附子之毒[15]

综上所述,笔者在本实验建立的液相检测方法能同时测定生附子中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量,且该方法简单、灵敏,可用于附子中双酯型生物碱的质量控制。

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<b>目的</b> 研究乌头类双酯型生物碱水解转化规律,建立LC-MS定性分析及HPLC定量分析乌头类双酯型生物碱及其水解产物<b>方法</b>。<b>方法</b> 通过控制乌头碱、新乌头碱、次乌头碱3种双酯型生物碱的水解条件,分别获得不同阶段的水解产物,从而推导各水解产物的精确质量浓度。<b>结果</b> 根据LC-MS定性分析<b>结果</b>,乌头类生物碱水解规律为乌头类双酯型生物碱先水解生成焦乌头碱类生物碱,再继续水解生成苯甲酰乌头原碱类生物碱;并根据水解规律分别计算出焦乌头碱类生物碱、苯甲酰乌头原碱类等乌头类生物碱水解产物的精确质量浓度。HPLC <b>方法</b>学表明,焦乌头碱、焦新乌头碱、焦次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱分别在0.70~44.64 μg·mL-1 (<i>r</i>=0.999 7;0.34~21.77 μg·mL-1 (<i>r</i>=0.999 9;0.38~24.37 μg·mL-1 (<i>r</i>=0.999 9;0.48~30.74 μg·mL-1 (<i>r</i>=0.999 9;0.41~26.38 μg·mL-1 (<i>r</i>=0.999 9;0.42~27.08 μg·mL-1 (<i>r</i>=0.999 7内线性关系良好。<b>结论</b> 本实验得出了乌头类双酯型生物碱水解转化规律,并建立了计算不同水解阶段水解产物的<b>方法</b>,其专属性高、定量简便,为乌头类生物碱及其水解产物的定量分析和乌头类中药材炮制、质量控制等提供了简便可行的<b>方法</b>。
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含量测定
色谱法
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Lateral roots of Debx.
Alkaloid
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杨海宁
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