目的 建立高效液相色谱法同时测定生附子中3种双酯型生物碱含量的方法。方法 采用WondaSil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为60 mmol·L-1醋酸铵溶液,B为乙腈:四氢呋喃(9:1),梯度洗脱;流速为1.0 mL·min-1;检测波长235 nm;柱温35 ℃。结果 新乌头碱、次乌头碱、乌头碱线性范围分别为0.526~10.520 μg(
Objective To establish a method for the determination of three kinds of diester alkaloids in lateral roots of Aconitum carmichaelii Debx. by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods The analysis was performed on WondaSil C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column.The mobile phase A was 60 mmol·L-1 ammonium acetate aqueous solution and mobile phase B was acetonitrile:tetrahydrofuran (9:1) with gradient elution at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 235 nm and column temperature was set at 35 ℃. Results The linear ranges of mesaconitine,hypaconitine and aconitine were 0.526-10.520 μg(
附子是毛茛科植物乌头(
普析L600型高效液相色谱仪(北京普析通用公司),检测器(北京普析通用公司,型号:L600-UV);色谱柱WondaSil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);XS105DU型电子天平(梅特勒-托利多仪器公司,感量:0.01 mg);BSA423S-CW型电子天平(北京塞多利斯科学仪器有限公司,感量:0.001 g);DTC-27型超声波清洗机(鼎泰生化科技设备制造有限公司)。
生附子(济南三株医院提供,批号:171225,180108,180302;产地四川,经济南三株医院牛纪江主任医师鉴定为毛茛科植物乌头
Wondasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) ;以60 mmol·L-1醋酸铵作为流动相A,以乙腈-四氢呋喃(9:1)为流动相B,梯度洗脱(0~50 min,26%→38%B),流速1.0 mL·min-1;柱温35 ℃; 波长235 nm;理论板数按乌头碱计算应≥3000,相邻两色谱峰分离度应>1.5。混合对照品、样品色谱图见
精密称取各对照品适量,用0.05%盐酸甲醇溶解,配成新乌头碱、次乌头碱、乌头碱(分别为0.526,0.522,0.108 mg·mL-1)混合对照品储备液。取该储备液1 mL,加0.05%盐酸甲醇至10 mL,定容,滤过,取20 μL进样。
取过筛孔内径0.15 mm(100目筛)生附子粉末1 g于具塞磨口锥形瓶中,精密加入1%盐酸10 mL,摇匀,超声处理30 min,放至室温,3000 r·min-1离心10 min(
精密吸取“2.2”项对照品储备溶液1,4,8,10,12,20 μL,分别进样测定峰面积,以对照品进样量为横坐标(
精密吸取混合对照品溶液20 μL,按上述色谱条件注入高效液相色谱仪,重复进样6次,记录色谱图。结果新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰面积的RSD 值分别2.97%,1.14%,2.39%,表明该色谱方法精密度良好。
精密称取已知含量的生附子药材粉末9份各1.000 g,分别精密加入新乌头碱、次乌头碱及乌头碱对照品溶液适量,使样品溶液中新乌头碱、次乌头碱及乌头碱含量为样品中相应物质含量的80%(3份)、100%(3份)、120%(3份)。照“2.3”项供试品溶液制备方法制备,照“2.1”项色谱条件测定3种双酯型生物碱含量,分别计算加样回收率及RSD值,结果见
精密吸取同一样品,分别于0,2,4,8,10,24 h 注入高效液相色谱仪,检测相应双酯型生物碱的峰面积,新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰面积RSD值分别为2.95%,3.01%,2.08%。结果表明采用酸水提取的供试品溶液在24 h内稳定性良好。
分别精密称定同一批生附子粉末6份,每份1 g,照“2.3”项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进行测定,记录各色谱峰面积。测得新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的峰面积RSD值分别为2.3%,1.1%,1.3%,结果表明本方法测定3种双酯型生物碱含量重复性良好。
附子中生物碱除极少部分以游离状态存在外,大部分以生物碱盐的形式存在于植物细胞。《中华人民共和国药典》2015年版采用氨水碱化样品,将生物碱游离出来,再提取。但实际操作中笔者发现,采用该方法提取双酯型生物碱,含量明显低于酸水直接提取。笔者在本实验中还考察了不同有机溶剂对结果的影响,结果显示,采用三氯甲烷提取时三氯甲烷易挥发,实验操作困难,结果可重复性差;采用异丙醇:乙酸乙酯(1:1)提取重复性较好,但操作繁琐,提取率偏低,约为1%酸水提取率的75%。同时,笔者在本实验中还考察了酸用量对实验结果的影响,结果表明,在1%盐酸溶液中,乌头碱稳定性优于0.5%盐酸。因此,笔者选择1%酸水作为最终提取液。
本实验中,笔者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氢呋喃-水等系统作为流动相的色谱情况。由于3种双酯型生物碱最佳检测波长约235 nm,采用甲醇-水系统时基线波动较大,不利于检测,而采用乙腈-水系统时可以有效避免基线波动,但乌头碱类生物碱属于含氮化合物,具有弱碱性,单纯使用乙腈-水系统会有拖尾峰出现,因此选择在水相中加入醋酸铵来改善峰型[7]。笔者在实验中发现,加入10 mmol·L-1醋酸铵时,仅对低浓度乌头碱峰形有改善作用,而随着乌头碱浓度增加,依然有拖尾,所以最终色谱条件选择60 mmol·L-1醋酸铵溶液作为水相。虽然乙腈-水-醋酸铵系统基线平稳,峰型较好,但3种双酯型生物碱分离度较差,调节流动相比例依然不能将其完全分离,而采用乙腈与四氢呋喃9:1混合作为有机相时,3种双酯型生物碱分离度良好。
附子毒性主要来源于双酯型生物碱,且该类化合物对Na+通道的II位点具有高亲和力,其可增加Na+内流,进而引起心律失常,导致严重急性毒性(LD50约0.15 mg·kg-1)[8]。双酯型生物碱稳定性差,经炮制和煎煮可水解成苯甲酰类单酯型生物碱及原碱,且随煎煮时间的变化,其含量呈现一定规律变化。生成的单酯类生物碱活性较强且毒性显著降低[9,10,11]。因此,现在临床煎剂及中成药中一般选用制附子。附子的传统炮制解毒方式较多,包括去皮、炮、炒、煨、烧、黑豆制、蜜制、姜制等[12]。在此基础上,有学者利用先进的科学技术,摸索出附子炮制新工艺,如邓文伟等[13]采用烘箱烘烤法成功制备出质量合格的制附子,杨明等[14]采用微波炮制出药效好、毒性低的附子。附子与其他中药配伍也能在一定程度上减轻其毒性,例如与甘草配伍,甘草中羧酸可与附子中生物碱发生缔合作用生成沉淀,进而降低附子之毒[15]。
综上所述,笔者在本实验建立的液相检测方法能同时测定生附子中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量,且该方法简单、灵敏,可用于附子中双酯型生物碱的质量控制。