目的 制备可用于经导管动脉化疗栓塞(TACE)的温敏纳米凝胶载药栓塞微球。方法 通过乳液聚合制备
Objective To prepare drug-loaded microspheres for embolization using temperature sensitive nanogels that can be used for transcatheter arterial chemoembolization (TACE). Methods Random copolymer PNA nanogels were prepared by emulsion polymerization and its particle morphology, drug-loaded capacity,temperature sensitivity, solution phase transition behavior were characterized.The formulation of PNA nanogels was optimized by orthogonal design test. Results Nanogels particles were relatively uniform sphere.The particle size was 50~150 nm.The feeding amount of AA had a significant effect on the doxorubicin loading and phase transition temperature of the drug-loaded temperature sensitive nanogels embolization microspheres.The drug loading rate was (19.01±0.82)%, and the phase transition temperature was (36.6±2) ℃ when the feeding amount of NIPAM, AA, MBA and SDS were 1.13, 0.32, 0.04 and 0.06 g, respectively. Conclusion The microspheres have high doxorubicin loading rate and suitable phase transition temperature, and might be used as a drug-loading and embolic material for TACE.
以经导管动脉化学治疗(化疗)栓塞(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)为代表的介入治疗是20世纪80年代发展起来的一种非手术肿瘤治疗方法,其操作简单易行、安全可靠,对患者创伤小,治疗费用较低,近期疗效显著,已经被公认为中晚期肝癌非手术疗法的首选方案,是肝癌患者姑息治疗及术前、术后辅助治疗的有效手段[1]。栓塞材料是决定治疗效果的关键因素,传统栓塞剂如明胶海绵、淀粉微球、聚乙烯醇(polyving akohol,PVA)等大小不等,形状不一,不易达到末梢栓塞的目的,一定程度上影响了介入治疗的效果[2]。而药物缓释微球(drug-eluting beads,DEB)栓塞剂具有标准的外形尺寸及局部缓释药物优势,能够栓塞末梢小动脉,维持时间较长,不易形成侧支循环;栓塞后能够在数天甚至数周内以较高浓度将药物缓慢释放到肿瘤血管内,用于肝癌的栓塞化疗取得很好的效果,因此受到越来越多的关注[3,4]。笔者在本实验中根据聚
AUW 220D型双量程分析天平(日本Shimadzu公司,感量:0.1 mg/0.01 mg);DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南予华仪器有限公司);GXZ-9240 MBE型鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);科伟数显电热恒温水浴锅;美国Labconco公司FreeZone 6L型台式冻干机;英国Malvern公司Nano-ZS 90型激光粒度仪;荷兰FEI公司Tecnai G2 20型透射电子显微镜(TEM);日本Hitachi公司F-4500型荧光分光光度计;美国Millipore公司Milli-Q超纯水系统。
称取共聚单体NIPAM 1.13 g、AA 0.08 g、交联剂MBA 0.08 g、乳化剂SDS 0.06 g于500 mL四口烧瓶,加水190 mL,搅拌使溶解。通氮气(N2)至液面以下,驱尽烧瓶内空气后升温至70 ℃。加入2 mg· mL-1引发剂KPS溶液10 mL,在N2氛围下反应5 h,得P(NIPAM-
取PNA纳米凝胶粉末适量,加水溶解并稀释制成0.1 mg·mL-1溶液,摇匀,取2滴于碳膜覆盖的400目铜网上,10 mg·mL-1磷钨酸染色后室温下晾干,透射电子显微镜观察,加速电压200 kV,结果见
取PNA纳米凝胶粉末约50 mg,加水10 mL使溶解,置于25~40 ℃恒温水浴,参照“粒度和粒度分布测定法”(《中华人民共和国药典》2015年版通则0982第三法),使检测器遮光率8%~20%,测定不同温度下溶液中纳米凝胶微球的粒径,每个测量温度下样品至少平衡5 min,结果见
吸取上述PNA溶液4 mL于透析袋(截留相对分子质量=14 000),扎紧袋口,放入装有0.5 mg·mL-1DOX溶液40 mL的锥形瓶,避光搅拌24 h。PNA纳米凝胶含羧基,可以通过离子键与DOX中氨基结合,即通过静电吸附作用负载药物。该过程可以自发完成,见
2.5.1 DOX标准曲线的绘制 精密称取DOX适量,用0.2 mg· mL-1纳米凝胶溶液溶解并定量稀释,制成40 μg·mL-1溶液,摇匀;精密移取1 mL于100 mL量瓶,0.2 mg· mL-1纳米凝胶溶液稀释至刻度,摇匀,作为DOX贮备液。分别精密移取DOX贮备液1.0,2.5,5.0,7.5 mL于10 mL量瓶,用0.2 mg· mL-1纳米凝胶溶液稀释至刻度,摇匀,参照“荧光分光光度法”(《中华人民共和国药典》2015年版通则0405),在激发波长505 nm、发射波长558 mn处测定供试品溶液的荧光强度[7]。以荧光强度(
2.5.2 测定法 精密称取温敏纳米凝胶载药微球(
2.5.3 重复性实验 按“2.5.2”项方法平行制备6份供试品溶液,依法测定并计算温敏纳米凝胶微球载药量。结果显示,载药量9.21%,6份供试品溶液日内精密度RSD为0.79%(
2.5.4 准确度实验 精密移取“2.5.3”项已准确测得载药量的供试品溶液10 mL于20 mL量瓶,分别加入DOX贮备液4,5,6 mL,加0.2 mg· mL-1纳米凝胶溶液稀释至刻度,摇匀,每个浓度平行配制3份。分别依法测定荧光强度,用DOX标准曲线的回归方程计算低、中、高浓度回收率,结果分别为(98.31±2.14)%,(101.11±2.61)%和(100.03±1.65)%,RSD分别为1.85%(
取温敏纳米凝胶载药微球20 mg于样品瓶中,加水1 mL,搅拌过夜使凝胶完全溶解。将样品瓶放入25~37 ℃恒温水浴,观察不同温度下溶液相变情况,见
2.7.1 正交设计实验 温敏纳米凝胶载药栓塞微球的载药量与相变温度是影响其栓塞性能和治疗效果的关键因素,与其处方密切相关。本研究固定NIPAM的投料量为1.13 g,以AA、MBA和SDS的用量为考察因素(分别记为A、B、C),每个因素选取3个水平,如
2.7.2 正交实验结果 以温敏纳米凝胶载药栓塞微球的载药量与相变温度为考察指标,数据处理采用“归一化法”,将每个指均转化为0~100%之间的“归一值”,并计算几何平均数,得总评归一值(overall desirability,OD)。计算公式如下,结果见
OD=(
其中
由正交实验直观分析结果可知,以综合评分为优化指标,各考察因素影响的重要性顺序为AA用量>MBA用量>SDS用量,以正交设计助手Ⅱ软件对实验结果进行方差分析,结果见
空列D为误差项,方差分析结果表明,AA用量对温敏纳米凝胶载药栓塞微球的载药量与相变温度具有显著影响,而MBA用量和SDS用量对载药量与相变温度的影响不显著。经优化后,最佳处方为A3B1C2,即AA用量为0.32 g,MBA用量为0.04 g,SDS用量为0.06 g。
2.7.3 优化处方的验证 按正交设计实验筛选的最佳处方,制备3批温敏纳米凝胶载药栓塞微球,并对其载药量和相变温度进行测定。结果表明,采用优选处方制备的3批栓塞微球载药量为(19.01±0.82)%,相变温度为(36.6±2)℃,表明正交设计实验优化的处方可靠,制备的温敏纳米凝胶载药栓塞微球具有较高的载药量和较高的相变温度,有望作为TACE的栓塞载药材料。
由于NIPAM结构同时含有亲水的酰胺基和疏水的异丙基,低于相变温度时,分子内氢键占主导,凝胶微球处于溶胀状态,体积较大。随着温度的升高,氢键被破坏,分子内疏水作用占主导,导致凝胶微球收缩,体积变小[10]。但是当温敏凝胶用于栓塞时,并不是通过微球本身完成栓塞,而是通过微球之间的疏水作用,形成宏观上的凝胶阻塞血管。因此可以避免小颗粒的温敏纳米凝胶载药栓塞微球通过肿瘤血窦或动静脉吻合口,使化疗药更多的进入人体循环,甚至通过肝血管床,在肺部及其他器官形成致命性误栓,导致肢体麻木、瘫痪、脑卒中、死亡等严重后果。
当指标较多时,每个指标优选的条件可能相互矛盾,对某一效应有利的条件可能对其他效应不利,如载药量和相变温度,前者要求越高越好,后者则不然。因此各效应间应达成妥协,使所有指标综合为一个可反映总体效应结果。本文采用Hassan“归一化”法,将每个指标数学转换,均标准化为0~1的总评“归一值”[11]。
温敏纳米凝胶载药微球具有液体栓塞剂的优点,流动性好,不需要高压注入,能避免栓塞剂反流或异位栓塞的发生,对不同形状、部位均能实现栓塞。而通过溶胶-凝胶转变实现栓塞,又具有颗粒栓塞剂的优点,粘度低,剪切变稀显著,相变行为丰富,具有较大强度。且以温度作为调控因素,避免有机溶剂和交联剂的使用,使用也更为安全,更适合用于血管栓塞[12]。