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美国《化学文摘》《国际药学文摘》
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日本科学技术振兴机构数据库（JST）
第七届湖北十大名刊提名奖
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目的 建立高效液相-柱后衍生-荧光检测法测定普瑞巴林含量的方法。方法 采用Waters C18色谱柱;流动相:水-甲醇(85:15);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:λex334 nm,λem455 nm;柱温:35 ℃。结果 普瑞巴林在8~80 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(
Objective To establish a HPLC method to measure the content of Pregabalin with post-column derivatization and fluorescence detection. Methods A Waters C18 column was adopted with mobile phase composed of water-methanol(85:15) at the flow rate of 1.0 mL·min-1 and column temperaturc at 35 ℃.The fluorescence detection wavelength was 334 nm(λex)and 455 nm(λem). Results The linear range was 8-80 μg·mL-1 (r=0.999 5).The average recovery was 99.82% with RSD of 0.80%(n=9). Conclusion The method is smiple,accurate,specific and sensitive for determination of content of Pregabalin by HPLC with post-column derivatization and fluorescence detection.
普瑞巴林化学名为(
Waters e2695高效液相色谱仪;2475 FLR-Detector荧光检测器;Waters柱后衍生系统,Empower 3色谱工作站;梅特勒T5自动电位滴定仪;XPE205分析天平(梅特勒-托利多公司,感量:0.01 mg)。
普瑞巴林对照品(中国食品药品检定研究院,批号:101106-201001,含量:99.8%);普瑞巴林(双鹤药业有限责任公司,批号:4003161002,4003161003,14003161004);0.05%氢氧化钠(NaOH)溶液(Pickering公司,批号:CB130),邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA)稀释液(Pickering公司,批号:CB910);甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
色谱柱:Waters C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(15:85);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:
取线性关系测定所用对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂,在上述色谱条件下进样,普瑞巴林保留时间约10.9 min,理论板数9658,空白溶剂无干扰,色谱图见
2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取普瑞巴林约20 mg,置100 mL量瓶,加50%甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取5 mL置50 mL量瓶,加50%甲醇水稀释至刻度,摇匀,即得。
2.2.2 OPA衍生液的制备 在衍生瓶中加入邻苯二甲醛稀释液(CB910)945 mL,称取邻苯二甲醛溶液100 mg置于甲醇10 mL中,经孔径0.45 μm有机膜滤过,将滤液加入衍生瓶;将巯基乙醇2 g溶解在邻苯二甲醛稀释液5 mL中,孔径0.45 μm有机膜滤过,然后加入到衍生瓶,摇匀,即得。
取普瑞巴林对照品约40 mg,精密称定,置100 mL量瓶,加水使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为标准贮备液,精密吸取标准贮备液1.0,2.0,2.5,5.0,8.0,10.0 mL,分别置50 mL量瓶,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,按照以上色谱条件,分别进样20 μL,以普瑞巴林质量浓度(
取样品(批号:4003161002)制备的供试品溶液,重复进样6次,记录峰面积,其峰面积RSD=0.56%。
取同一批号样品(批号:4003161002)6份,分别按供试品溶液制备项下平行制备供试品溶液,按上述色谱条件进样,测定。结果表明样品中普瑞巴林平均含量99.72%,RSD=0.68%。
取样品(批号:4003161002)制备的供试品溶液,按上述色谱条件分别于0,2,4,6,8,12 h测定,其峰面积的平均值为3 162 708 584,RSD=0.26%。
精密称取已知含量样品(批号:4003161002)适量,加入对照品适量,按“2.2”项配制成相当于含量测定浓度80%,100%,120%的供试品溶液各3份。按上述色谱条件,测定含量,计算回收率,结果见
表1 普瑞巴林加样回收率测定结果
Tab.1 Results of recovery test of pregabalin
取样品3批,依法制备供试品液,分别按照“2.1”项色谱条件测定其峰面积,标准曲线法计算含量,同时取上述3批样品各约0.1 g,用醋酸40 mL溶解,0.1 mol·L-1高氯酸滴定液电位滴定法测定含量。结果两种方法测定含量基本一致,见
表2 两种方法样品含量测定结果比较
Tab.2 Comparison of content determination on the samples by using two methods
取上述对照品线性溶液,固定激发波长于330 nm处,在390~490 nm范围内扫描发射波长,结果在455 nm处有最大吸收;固定发射波长于455 nm处,在300~435 nm范围内扫描激发波长,结果在334 nm处有最大吸收。故检测激发波长定为334 nm,发射波长定为455 nm。
笔者在本实验中分别考察4种样品溶解溶剂:水[5]、甲醇[2]、50%乙腈[7]和50%甲醇,结果50%甲醇和50%乙腈相对水和甲醇能很好地溶解样品,且都能符合系统适用性专属性要求,考虑甲醇相对乙腈更经济且毒性小,本实验流动相组成又为甲醇-水系统,50%甲醇也能更好地降低溶剂效应,故选50%甲醇做溶剂。
笔者在本实验中考察了流动相:甲醇-乙腈-20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值7.0)(350:100:550)[3]、水-乙腈(85:15)和水-甲醇(85:15),结果3种流动相均能满足检测系统适用性要求,但第一种流动相组成响应相对较低,后两种流动相除了在保留时间有差别,峰型均对称尖锐,响应较好,考虑经济、简便,选择水-甲醇(85:15)作为流动相组成。本法操作简便、快速、准确、灵敏、专属性强,适用于普瑞巴林的含量测定。
