目的 通过建立准确可靠的定值方法及不确定度分析研究,研制具有可溯源和量值传递功能的黄芩及其水、95%乙醇提取物中黄芩素成分分析标准物质。方法 根据《中华人民共和国计量法》和标准物质研制技术规范与相关技术文件要求,利用黄芩素国家一级纯度标准物质的量值传递功能,采用高效液相色谱法对黄芩及其水、95%乙醇提取物中黄芩素成分分析标准物质进行均匀性和稳定性检验;采用高效液相色谱法-多家实验室协作标定的方法,确定黄芩中药材、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分的含量标准值及不确定度评估。结果 所研制的黄芩及其水、95%乙醇提取物中黄芩素成分分析标准物质均具有良好的均匀性和稳定性,黄芩素成分含量分别为(7.95±0.23)%,(4.29±0.12)%,(8.80±0.40)%(
Objective Through establishing accurate, reliable analytical method of evaluation and uncertainty analysis, to develop the certified reference materials (CRMs) of baicalein in
用95%乙醇提取中化学成分是研究中草药中活性物质的主要提取方法,而水煎法是数千年来中药材在临床疾病治疗时的主要用药方式,95%乙醇提取物和水提取物中均含有治疗疾病的活性化学物质。因此,研制中药材95%乙醇提取物及水提取物标准物质,并以黄芩素作为指标成分定值,具有科学意义和实际应用价值[6]。
笔者在本实验完成了黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分分析国家级标准物质的研制,确定了药材、醇提物、水提物3种不同基质中黄芩素成分含量的标准值与不确定度值[7]。黄芩及其提取物中黄芩素成分分析标准物质的研制,可为我国黄芩中药材及中成药研制和产品质量控制提供物质基准。
Agilent1200型高效液相色谱仪:美国安捷伦科技公司,DAD检测器,Agilent chemstation工作站;XS105型电子分析天平(Mettler公司,感量:0 g≤
化学纯标准物质,证书编号:GBW09516,纯度标准值及不确定度值(99.72±0.25)% (
1.3.1 黄芩中药材 产地河北省,经中国医学科学院药物研究所马林教授鉴定为正品,质量检查符合《中华人民共和国药典》2015年版规定要求[1]。黄芩中药材经除尘、粉碎、并过筛孔内径(250±9.9) μm(65目)筛,备用。精密称取样品1 g置棕色安瓿瓶密封包装,共完成500支最小包装1 g量的黄芩中药材成分分析标准物质候选物样品的制备工作。
1.3.2 黄芩95%乙醇提取物 取黄芩中药材,粉碎后以5倍量95%乙醇作为提取溶剂,经加热回流提取3次,合并提取液,减压浓缩得浸膏,真空干燥,粉碎并过筛孔内径(250±9.9) μm(65目)筛,得棕红色干粉,即为黄芩95%乙醇提取物,备用。精密称取样品100 mg,置棕色安瓿瓶密封包装,共完成500支最小包装100 mg量的黄芩95%乙醇提取物成分分析标准物质候选物样品的制备工作。
1.3.3 黄芩水提取物 取黄芩中药材粉碎,加入6倍量纯净水,煎煮1 h,滤过,得提取液,将药渣加入与提取液等体积的纯净水,煎煮1 h,滤过,再次向药渣中加入与提取液等体积纯净水,继续煎煮1 h,滤过。合并上述提取液,水浴挥干后,75 ℃真空干燥,得棕色粉末,即为黄芩水提取物,备用。精密称取100 mg样品置于棕色安瓿瓶密封包装,共计完成了500支最小包装100 mg量的黄芩水提取物成分分析标准物质候选物样品的制备工作。
甲醇(Fisher Chemical,色谱纯),磷酸(分析纯,北京化学试剂公司),娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。
2.1.1 色谱条件 Agilent XDB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 mm);流动相:甲醇:0.4%磷酸=51:49;梯度洗脱程序:0~17 min(51%甲醇);17~25 min(51%→70%甲醇);后运行5 min;流速1.0 mL·min-1;柱温35 ℃;进样量10 mL;检测波长275 nm。
2.1.2 溶液的制备 标准储备液制备方法:精密称取黄芩素化学纯标准物质5.09 mg(按化学纯度99.72%计),置于50 mL量瓶,用色谱级甲醇将样品完全溶解,并定容至刻度,摇匀,配制成黄芩素为101.52 mg·L-1标准储备液。精密移取0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 mL分别置于10 mL量瓶,用色谱级甲醇稀释至刻度,获黄芩素为1.0,5.1,10.2,20.3,50.8,101.5 mg·L-1标准溶液。
样品提取方法:精密称取黄芩中黄芩素成分分析标准物质样品100 mg、黄芩95%乙醇提取物中黄芩素成分分析标准物质样品30 mg、黄芩水提取物中黄芩素成分分析标准物质样品30 mg,分别置具塞锥形瓶,精密加95%乙醇:盐酸=7:3混合溶液20 mL(95%乙醇提取物、水提取物为10 mL),置90 ℃水浴中回流3 h,放冷,滤过,滤液置100 mL量瓶,用少量95%乙醇分次洗涤容器和残渣,洗液滤入同一量瓶中,加95%乙醇至刻度,摇匀。准确量取1 mL,分别置10 mL量瓶,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
2.2.1 线性关系考察 分别精密移取6种不同浓度标准溶液10 μL,注入液相色谱仪,按照“2.1.1”项色谱条件,记录色谱图及峰面积。色谱峰面积分别为38.68,198.35,389.67,802.44,1982.56,4003.11,以黄芩素标准溶液浓度为横坐标(
2.2.2 精密度实验 精密吸取101.5 mg·L-1黄芩素标准储备液1 mL至10 mL量瓶,用色谱纯甲醇稀释至刻度。采用高效液相色谱法,按照“2.1.1”项色谱条件,重复测定6次,记录色谱图,黄芩素峰面积分别为369.68,369.82,369.33,369.47,369.60,369.66,RSD为0.05%,表明仪器精密度良好。
准确称取自制黄芩素纯度标准物质5.09 mg(按化学纯度99.72%计)6份,置50 mL量瓶,用甲醇将样品溶解,并定容至刻度,获得101.52 mg·L-1标准储备溶液。准确吸取1.0 mL置10 mL量瓶,用甲醇稀释至刻度。采用高效液相色谱法,按照“2.1.1”项色谱条件,各重复进样3次,分别记录色谱图,获得黄芩素色谱面积均值/称样量为72.953,72.423,72.770,72.246,72.017,72.182,RSD为0.50%,表明实验方法精密度良好。
2.2.3 重复性实验 分别称取黄芩中药材、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物样品各6份,按照“2.1.2”项样品提取方法,按照“2.1.1”项色谱条件进行测定。黄芩中黄芩素含量分别为8.084%,8.160%,8.162%,8.174%,8.005%,8.284%,平均8.145%,RSD 1.15%;黄芩95%乙醇提取物中黄芩素含量分别为4.333%,4.301%,4.342%,4.282%,4.284%,4.292%,平均4.306%,RSD为0.60%;黄芩水提取物中黄芩素含量分别为9.165%,9.122%,9.021%,9.070%,8.873%,9.026%,平均9.046%,RSD为1.12%。表明黄芩中药材、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物系列标准物质溶液制备方法重复性良好。
2.2.4 回收率实验 分别称取黄芩中药材100 mg、黄芩95%乙醇提取物30 mg、黄芩水提取物样品30 mg各6份,分别加入黄芩素纯度标准物质作为加标样品。按照“2.1.2”项样品提取方法制备样品,采用HPLC法按照“2.1.1”项色谱条件测定黄芩素含量,计算回收率。黄芩中黄芩素回收率分别为100.50%,99.45%,98.64%,99.64%,99.77%,97.91%,平均回收率99.32%,RSD为0.92%;黄芩95%乙醇提取物中黄芩素回收率分别为100.89%,99.90%,98.79%,101.84%,98.34%,101.52%,平均回收率为100.21%,RSD为1.44%;黄芩水提取物中黄芩素的回收率分别为100.32%,99.47%,100.65%,101.63%,99.01%,99.02%,平均回收率100.02%,RSD为1.04%,结果表明方法回收率良好。
从500 支标准物质候选物中采用简单随机抽样方法抽取15 瓶样品,每瓶样品平行取样3 份,均按照“2.1.2”项样品提取方法,按照“2.1.1”项色谱条件测定黄芩素含量,分别获得45 个均匀性检验数据。黄芩中药材、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物的均匀性数据见
采用单因素方差分析(One Way Anova)[8]对均匀性数据进行组内和组间统计分析,测定黄芩中药材、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素含量,
将密封包装后的标准物质候选物样品放置在常温条件下长期保存,考察样品稳定性,并分别于0,1,2,4,6,12 个月随机抽样,每个点随机抽样6 瓶,按照“2.1.2”项样品提取方法,按照“2.1.1”项色谱条件测定黄芩素含量,实验测定结果见
黄芩中黄芩素:
黄芩95%乙醇提取物中黄芩素:
黄芩水提取物中黄芩素:
三者自由度均为:
依据国家标准物质技术规范[10],采用6家实验室联合定值方法对黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分进行定值,定值数据见
2.6.1 成分含量标准值的不确定度评估 黄芩、黄芩95%乙醇提取物、黄芩水提取物中黄芩素成分分析标准物质的总不确定度由3个部分组成:测量标准值引入的不确定度、样品不均匀性引入的不确定度、样品稳定性引入的不确定度。其中,测量标准值引入的不确定度包含国家一级标准物质引入的不确定度、中药材及其提取物中有效成分提取及含量测定过程引入的不确定度以及联合定值的标准曲线拟合引入的不确定度等。
2.6.2 标准值的不确定度计算 ①黄芩素一级标准物质引入的不确定度值
黄芩中黄芩素:
黄芩95%乙醇提取物中黄芩素:
黄芩水提取物中黄芩素:
③联合定值的标准曲线拟合引入的不确定度值
比较6家单位获得的标准曲线相对标准不确定度值,取最大值分别为:黄芩中黄芩素成分含量标准曲线的不确定度
④合成标准不确定度计算,按照
2.6.3 样品均匀性引入的不确定度
2.6.4 样品稳定性引入的不确定度
2.6.5 总合成标准不确定度 按照
2.6.6 扩展不确定度 由总合成标准不确定度计算扩展不确定度(
在测量不确定度的最终计算中,一般采用只进不舍的规则。故黄芩中黄芩素成分分析标准物质定值结果为(7.95±0.23)%,
笔者在本实验通过采用单一化学成分标识复杂成分体系的量值传递技术路线,采用高效液相色谱法-多家实验室协作标定的方法,成功研制了黄芩中黄芩素成分分析标准物质GBW(E)090438、黄芩95%乙醇提取物中黄芩素成分分析标准物质GBW(E)090447、黄芩水提取物中黄芩素成分分析标准物质GBW(E)090453,解决了中药材及其提取物等复杂体系中的相关化学成分的量值溯源性科学技术难题,为中药相同类型标准物质的研制起到了指导和示范作用。
笔者在本实验研制的黄芩及其提取物中黄芩素成分分析系列标准物质均含有准确的量值与不确定度,属国家二级计量有证标准物质,具量值溯源和量值传递功能,在国内外均属首次研制,填补了标准物质领域的品种空白。同时为提高我国中药材及中成药的质量标准、推动中药的标准化和现代化提供了标准物质、物质标准、标准技术方法。
The authors have declared that no competing interests exist.