GNP-9080生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司);MJPS 150生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司);生物安全柜[型号:Thermo Forma/1300,赛默飞世尔科技(中国)有限公司];超净工作台(型号:SW-CJ-1FD,苏州净化设备有限公司)。

人工牛黄(江苏某制药有限公司,批号:20170402,20170512,20170527)。

胰酪大豆胨琼脂培养基(批号:1702042)、沙氏葡萄糖琼脂培养基 (批号:1702132)、胰酪大豆胨液体培养基(批号:161205)、肠道菌增菌液体培养基 (批号:1603022)、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基(批号:1601142)、麦糠凯液体培养基(批号:161227)、麦糠凯琼脂培养基(批号:160225)、RV沙门菌增菌液体培养基 (批号:1602152)、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 (批号:161130)、三糖铁琼脂培养基(批号:151221)均由北京三药科技开发公司提供。

金黄色葡萄球菌( Staphylococcusaureus) [CMCC(B)26 003];大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC (B)44 102];铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[ CMCC ( B )10 104];枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[ CMCC(B)63 501];白念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F)98 001];黑曲霉(Aspergilllus niger)[CMCC(F)98 003];乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B ) [CMCC(B)50 094]均购自中国食品药品检定研究院。

2.1.1 菌液的制备 分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基,30~35 ℃培养18~24 h,分别取上述培养物用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,依次稀释制成每毫升含菌数<100 菌落形成单位(colony-forming unit,cfu)菌悬液;分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基,30~35 ℃培养18~24 h,分别取上述培养物用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每毫升含菌数为100~10 000 cfu菌悬液;接种白念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基,20~25 ℃培养2~3 d,取此培养物用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,稀释制成每毫升含菌100~10 000 cfu的菌悬液;将黑曲霉斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上,20~25 ℃培养5~7 d,使大量孢子成熟。加入含0.05%聚山梨酯80的pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液3~5 mL,将孢子洗脱。然后用管口带有薄无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管,用含0.05%聚山梨酯80的pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每毫升含孢子100~10 000 cfu的孢子悬液。

2.1.2 供试液的制备 称取供试品10 g,加胰酪大豆胨液体培养基至100 mL,充分振摇使混匀,作为1:10供试液;取1:10供试液10 mL,加胰酪大豆胨液体培养基至100 mL,充分振摇使混匀,作为1:100供试液。

2.1.3 计数方法及回收率计算 取稀释级别分别为1:10,1:100供试液9.9 mL与每毫升含菌数为100~10 000 cfu的各实验菌0.1 mL混匀,作为实验组。以稀释级别1:10,1:100 供试液9.9 mL和胰酪大豆胨液体培养基0.1 mL混匀作为供试品对照组;以9.9 mL胰酪大豆胨液体培养基和每毫升含菌数为100~10 000 cfu的各实验菌0.1 mL混匀,同法操作,作为菌液对照组。分别吸取上述各处理组1 mL注入平皿,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20 mL,混匀,凝固,于30~35 ℃倒置培养3 d,点计菌落数。计算各实验菌回收率,实验组菌回收率(%)=(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。结果见表1。

由表1可知,采用稀释级别为1:10及1:100的供试液对人工牛黄需氧菌总数计数方法进行验证,部分实验菌株实验组回收率<50%,不满足《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1105中对于实验组菌落回收率的要求。采用含3%聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基作为稀释液稀释供试品,去除供试品抑菌活性,重新进行需氧菌计数方法适用性实验。

2.2.1 供试液的制备 以含3%聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基作为稀释液配制样品。取供试品10 g,加上述稀释液至100 mL,充分振摇混匀,作为1:10供试液;取1:10供试品20 mL,加上述稀释液至100 mL,充分振摇使混匀,作为1:50供试液。

2.2.2 计数方法及回收率计算 按“2.1.3”项方法制备各实验菌株实验组、菌液对照组、供试品对照组并培养计数,同时以含3%聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液,作为中和剂对照组,按“2.1.3”项方法处理。分别计算实验组菌株回收率及中和剂对照组菌落数回收率,结果见表2。

由表2可知,以含3%聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂,采用1:50 稀释级别进行需氧菌总数计数方法适用性实验时,所有菌种实验组回收率均在50%~200%,采用该方法对批号为20170512,20170527样品再独立进行两次需氧菌计数方法适用性实验,以确认该方法的可靠性。结果见表3。

按照“2.2.1”项方法制备供试液;以白念珠菌、黑曲霉作为实验菌株,按照“2.1.3”项方法制备各实验菌株实验组、菌液对照组;按照“2.2.2”项方法制备中和剂对照组。分别吸取上述各组1 mL注入平皿,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15~20 mL,混匀,凝固,于20~25 ℃倒置培养5 d点计菌落数,结果见表4。

由表4结果可知,以含聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂,采用1:10稀释级别进行真菌和酵母菌总数计数方法适用性实验时,所有菌种实验组回收率均符合要求,采用此方法对批号为20170512,20170527的样品再独立进行两次真菌和酵母菌总数计数方法适用性实验,以确认该方法的可靠性。结果见表5。

依据《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1107中非无菌微生物限度标准要求^[4],本品控制菌检查项目标准为:不得检出大肠埃希菌(1 g);不得检出沙门菌(10 g);耐胆盐革兰阴性菌应小于10² (1 g)。

2.4.1 大肠埃希菌检查方法适用性实验 取1:10供试液10 mL,每毫升含菌数<100 cfu的大肠埃希菌菌悬液1 mL,加至约100 mL胰酪大豆胨液体培养基,作为实验组;取胰酪大豆胨液体培养基10 mL,加至约100 mL胰酪大豆胨液体培养基,作为阴性对照组;取每毫升含菌数<100 cfu大肠埃希菌菌悬液1 mL,加至约100 mL胰酪大豆胨液体培养基作为阳性对照组。以上各处理组均置于30~35 ℃培养18 h。

分别取各组培养物1 mL,接种至含100 mL麦康凯液体培养基内培养,42~44 ℃培养24 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上30~35 ℃培养18 h,结果见表6。

2.4.2 乙型副伤寒沙门菌检查方法适用性实验 取10 g供试品和每毫升含菌数不大于100 cfu的沙门菌菌悬液1 mL,置100 mL胰酪大豆胨液体培养基,作为实验组;取10 mL胰酪大豆胨液体培养基,置100 mL胰酪大豆胨液体培养基,作为阴性对照组;取每毫升含菌数不大于100 cfu沙门菌菌悬液1 mL,置100 mL胰酪大豆胨液体培养基,作为阳性对照组;各处理组置于30~35 ℃培养18 h。

分别取上述培养物各0.1 mL,分别接种至10 mLRV沙门菌增菌液体培养基,30~35 ℃培养18 h。取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上,30~35 ℃培养18 h。用接种针挑取疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培养18 h。结果见表7。

2.4.3 耐胆盐革兰氏阴性菌检查方法适用性实验 称取供试品10 g,加入胰酪大豆胨液体培养基至100 mL制成1:10供试液,混匀,20~25 ℃培养2 h,分别取此供试液1,0.1,0.01 mL(相当于供试品0.1,0.01,0.001 g),接种至10 mL肠道菌增菌液体培养基,分别加入不大于100 cfu的大肠埃希菌悬液1 mL,作为实验组,同法制备铜绿假单胞菌实验组;将1 mL胰酪大豆胨液体培养基接种至肠道增菌液体培养基10 mL中,加入不大于100 cfu的大肠埃希菌悬液1 mL,作为阳性对照组,同法制备铜绿假单胞菌阳性对照组;将1 mL胰酪大豆胨液体培养基接种至肠道增菌液体培养基10 mL中,作为阴性对照组。以上各处理组于30~35 ℃培养24 h。

分别将各组培养物划线接种至紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上,于30~35 ℃培养24 h。结果见表8。